obschaya_mikrobiologia_metodicheskie_ukazania

ний. В настоящее время человек использует в качестве дезинфектантов огромное количество химических соединений.

Химические дезинфицирующие средства

1. Хлорсодержащие препараты.

Наиболее часто используемые дезинфицирующие вещества. Их действие обусловлено выделением при применении чистого хлора. Родоначальником всего семейства является хлорная известь – белый кристаллический порошок с резким запахом хлора. К ним относятся:

-двутретиосновная соль хлорида кальция (ДТСГК) – препарат, сходный с хлорной известью, но содержащий до 50% активного хлора;

-хлорамин (БХБ) – белый или слегка желтоватый порошок со слабым запахом хлора. Содержит до 30 % активного хлора. В отличие от хлорной извести хлорамин не разрушает ткани и краски;

-дезам, дихлор, хлорцин, гипохлориты и другие.

2. Детергенты дезинфицирующего действия.

Содержат в своем составе поверхностно-активные вещества (ПАВ), в сочетании с которыми другие дезинфектанты, содержащиеся в них, многократно усиливают свое действие. Широко известны отечественные препараты "Универсальный", "Уральский", "Вита", "Сана", "Белка", "Посудомой", "Блеск", "Кама", "Санитарный", "Джалита", "Санита".

3.Окислители: перекись водорода (предназначены для дезинфекции изделий из коррозионностойких металлов, а также других материалов: резины, пластмассы, стекла), перманганат калия.

4.Спирты (метанол, этанол и изопропранолол) рекомендованы только для дезинфекции инструментов из металлов. Для дезинфекции изделий из других материалов разрешены к применению средства на основе спиртов и катионных ПАВ: Гибитан, Велтосепт. Средства, содержащие спирты, обладают свойством фиксировать загрязнения органического происхождения, что обусловливает необходимость предварительного отмывания загрязненных изделий перед дезинфекцией с соблюдением противоэпидемических мер. Имеют хорошую активность против бактерий и вирусов. Этиловый спирт применяется чаще всего в 70% концентрации.

5.Чистые растворимые фенолы (стеркол и хайколин).

Убивают большинство бактерий, включая микобактерии туберкулёза, но у них ограниченная активность против вирусов.

6. Альдегиды обладают щадящим действием по отношению к материалам, из которых изготавливаются медицинские изделия: Глутарал, Глутарал- Н, Бианол, Сайдекс, Гигасепт ФФ, Лизоформин-3000, Дезаформ, Альдазан2000, Секусепт-Форте (производные глютаральдегида и формальдегида).

Активны против бактерий, вирусов и грибов, но медленно работают против бактерий туберкулёза, раздражают кожу и глаза.

Надо помнить, что химические вещества могут быть токсичными при контакте с кожей или вдыхании, могут вызвать коррозию и воспламенение, поэтому защитная одежда (перчатки, фартук и маска) необходима. Химические дезинфектанты поставляются готовыми к употреблению или нуждаются

51

в точном разведении до определенной концентрации. Надо также помнить, что дезинфектанты со временем могут терять активность. Потеря активности происходит быстрее при высоких температурах и может усиливаться в присутствии примесей. При использовании дезинфектантов требуется определённая экспозиция.

Классификация медицинских инструментов и предметов ухода за больными в зависимости от степени риска инфицирования пациентов, связанного с использованием этих предметов. Выделяют три категории: 1) "критические" инструменты и предметы ухода; 2) "полукритические" инструменты и предметы ухода; 3) "некритические" инструменты и предметы ухода.

"Критические" предметы – это инструменты, проникающие в кровоток и стерильные в норме ткани организма. К ним, например, относятся хирургические инструменты, сердечные катетеры, имплантаты. В случае контаминации их любыми микроорганизмами возникает значительный риск инфицирования пациентов. Таким образом, инструменты и предметы, относящиеся к данной категории, должны быть стерильными. Особую проблему представляют термолабильные инструменты, которые не могут подвергаться стерилизации, например, лапароскопы. Стерилизация газом окиси этилена или жидкими химическими средствами требует продолжительного времени, поэтому во многих стационарах для этого вида инструментов используют дезинфекцию высокого уровня. Однако эта процедура не уничтожает полностью споры бактерий, что увеличивает риск инфицирования пациентов.

"Полукритическими" считают предметы, контактирующие со слизистыми оболочками или поврежденной кожей (например, ингаляторы, бронхоскопы и эндоскопы). Полукритические инструменты должны подвергаться тщательной очистке с последующей дезинфекцией, которая удаляет все микроорганизмы и споры большинства бактерий.

"Некритические" предметы контактируют только с неповрежденной кожей (например, манжеты для измерения артериального давления, стетоскопы, подкладные судна). Эти предметы не требуют строгой стерильности и могут содержать на своей поверхности споры бактерий.

В зависимости от вида предмета медицинского назначения и цели его применения проводят дезинфекцию высокого (ДВУ), среднего (ДСУ) и низкого уровней (ДНУ).

При проведении ДВУ погибают все микроорганизмы, кроме спор бактерий. Этот метод дезинфекции должен использоваться для всех "полукритических" предметов. Для ДВУ применяют глутаровый альдегид, диоксид хлора, 6% раствор перекиси водорода и средства на основе надуксусной кислоты. Эти химические средства можно использовать и для стерилизации, однако время экспозиции при этом значительно увеличивается.

При проведении ДСУ погибают вегетативные формы бактерий, в том числе микобактерии, большинство вирусов и грибов (кроме спор бактерий). Мелкие нелипидные вирусы (например, энтеровирусы, риновирусы) более устойчивы к бактерицидным средствам, в то время как крупные липидные вирусы, такие как герпесвирусы, вирус гепатита В и ВИЧ, обычно погибают при проведении ДСУ. ДСУ должна использоваться для "некритических" предметов. Этот метод также может применяться для дезинфекции некоторых "полукритических" предметов, таких как ванны для гидротерапии пациентов с поврежденной кожей. К средствам ДСУ относятся соединения на основе 70% и 90% этилового или изопропилового спирта, хлорсодержащие препараты, некоторые фенолсодержащие средства и йодоформы.

52

При проведении ДНУ погибают вегетативные формы большинства видов бактерий, вирусы и грибы. Не погибают споры бактерий, микобактерии и мелкие нелипидные вирусы. ДНУ можно использовать только для "некритических" инструментов. К дезинфектантам низкого уровня относятся препараты на основе четвертичных аммониевых соединений, некоторые йодоформы и фенолсодержащие препараты.

Некоторые современные дезинфектанты.

Сальваниос. Применяется для дезинфекции жестких и гибких эндоскопов и инструментов к ним, стоматологических и хирургических инструментов, для дезинфекции поверхностей в лечебно-профилактических и детских учреждениях, в гостиницах, общежитиях, бассейнах, банях, предприятиях общественного питания и продовольственной торговли. Не содержит хлора и альдегидов, не вызывает коррозию. Активен против вирусов (включая ВИЧ и гепатиты), бактерий (включая возбудителей туберкулеза) и грибов. Не токсичен, рабочий раствор сохраняет свои свойства в течение 10 дней после приготовления).

Сурфаниос. Более мощное средство. Применяется для дезинфекции поверхностей в операционных блоках, отделениях интенсивной терапии, родильных домах, санитарно-технического транспорта, для дезинфекции медицинских отходов перед утилизацией; в детских учреждениях; на объектах коммунального хозяйства и социальных служб; предприятиях общественного питания; в очагах особо опасных инфекций; для мытья и дезинфекции посуды, белья, уборочного инвентаря и т.д. Не содержит хлора и альдегидов, спирта, фенола и др. токсичных веществ, не вызывает коррозию. Активен против вирусов (включая ВИЧ и гепатиты), бактерий (включая туберкулез) и грибов. Активен в отношении плесени!!! Не токсичен, рабочий раствор сохраняет свои свойства в течение 14 дней после приготовления.

Стераниос. При 5-часовой экспозиции обеспечивает стерилизацию. Не токсичен, рабочий раствор сохраняет свои свойства в течение 30 дней после приготовления.

Аниоксид. Дезинфектант высшего уровня. Активен в отношении всего спектра патогенов и, между тем, настолько нетоксичен и экологичен, что его можно сливать в обычную канализацию.

Жавель солид. Хлорсодержащий дезинфектант в виде таблеток. В 1 таблетке до 1,5 г хлора.

Аппаратная дезинфекция. Основана на сочетании всех способов (механической, физической и химической) дезинфекции и специального оборудования.

1.Пароформалиновые камеры. Смесью паров формалина и воды дезинфицируются матрасы, постельные принадлежности, одежда, обувь и другая утварь, в том числе книги и архивные материалы, которые нельзя дезинфицировать растворами.

2.Паровые камеры. Не используют пары формалина, ограничиваясь водяным паром при температуре около 105 ºС (дезинфекция текучим паром).

53

Отличает от автоклавов большая вместимость, но меньшая степень воздействия на единицу площади.

3.Моечно-дезинфекционные автоматы. Автоматическая обработка ин-

струментов сводит к минимуму ошибки и позволяет провести процесс мойки в полном соответствии с современными требованиями к её качеству. Хорошие автоматы очень качественно моют и дезинфицируют стеклянную и фарфоровую посуду, хирургический и другой металлический инструментарий, анестезиологическое оборудование, обувь, жесткие эндоскопы. В таких автоматах наряду с химической используется термическая дезинфекция. Некоторые модели оборудованы воздушной сушкой. Для дезинфекции гибких эндоскопов и санитарного оборудования (подкладные судна и мочеприемники) выпускаются специальные автоматы.

4.Ультразвуковая очистка. Эффективность дезинфекции повышается при сочетании с дезинфицирующими средствами. Незаменима в качестве предстерилизационной обработки хирургического инструментария. Процесс очистки в таких устройствах основан на так называемой кавитации - образовании мельчайших пузырьков воздуха под воздействием ультразвуковой волны. Эти пузырьки с большой силой отрывают от поверхности очищаемого предмета все посторонние частички. Использование ультразвуковых моющих ванн незаменимо при очистке инструментов и изделий со сложной или шероховатой поверхностью или с внутренними полостями.

Оформление лабораторной тетради

Описать ход исследования при выделении чистой культуры аэробов (3-й день); зарисовать микропрепараты возбудителей столбняка, ботулизма, газовой гангрены; записать методы культивирования анаэробов; зарисовать с таблицы схему выделения чистой культуры анаэробов; зарисовать фазы роста микробной популяции.

ЗАНЯТИЕ 8

Тема: ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АППАРАТ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ.

ВИДЫ ИЗМЕНЧИВОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ

Цель занятия: изучить фенотипическую и генотипическую изменчивость микроорганизмов, познакомиться с классификацией мутаций бактерий, оценить последствия изменчивости для бактериальных клеток.

54

План занятия

1.Организация генетического материала бактерий. Репликация ДНК. Генотип и фенотип.

2.Изменчивость микроорганизмов и ее виды.

3.Модификации у бактерий.

4.Мутации у бактерий. Отличие мутаций от других видов изменчивости микроорганизмов. Классификация мутаций по происхождению, молекулярным механизмам и последствиям для бактериальной клетки.

5.Практическое использование учения о мутациях.

Задания для выполнения лабораторной работы

1. Изучить феномен роения Proteus mirabilis на питательном агаре и на агаре с 1% сухой желчью в чашках Петри.

Выявление фенотипической изменчивости можно провести в опыте с феноменом роения у Proteus mirabilis. Сначала изучают колонии бактерий рода Proteus, выросшие на питательном агаре в чашке Петри через 24 ч после посева разведенной культуры. Отмечают, что все колонии протея окружены «зоной роения». Пересевают колонии петлей на поверхность агара с 1% желчью в чашках Петри и инкубируют при 37 оС 18–24 ч. Все колонии протея, выросшие на питательном агаре с желчью, не имеют «зон роения». Вновь пересевают колонию в чашку Петри с питательным агаром и инкубируют при 37 оС 18–24 ч. Наблюдают, что все колонии, выросшие на питательном агаре, окружены «зоной роения».

Изменение фенотипа протея на питательной среде с желчью (утрату роения) следует считать модификацией, т.к. налицо все три ее отличительных признака: определенность (связь отсутствия роения с определенным фактором – желчью), общность изменений (утрата роения наблюдается у всех колоний популяции), обратимость (при отсутствии желчи в питательной среде восстанавливается исходный фенотип).

55

Оформление лабораторной тетради

Зарисовать феномен «роения» Proteus mirabilis на чашке Петри с МПА; записать виды изменчивости микроорганизмов.

ЗАНЯТИЕ 9

Тема: ГЕНЕТИЧЕСКИЕ РЕКОМБИНАЦИИ У БАКТЕРИЙ. ВНЕХРОМОСОМНЫЕ ФАКТОРЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ.

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ

Цель занятия: познакомиться с процессами обмена генетической информацией у бактерий; изучить явления трансформации, коньюгации и трансдукции в бактериальных клетках; оценить роль умеренного бактериофага в переносе генетической информации, определить роль внехромосомных генетических элементов для бактерий, познакомиться с молекулярногенетическими исследованиями.

План занятия

1.Рекомбинация – обмен генетической информацией.

2.Трансформация, ее механизм, основные этапы.

3.Коньюгация. Роль полового фактора. F+, F־, Hfr-клетки.

4.Трансдукция, ее механизм. Роль умеренного бактериофага.

5.Внехромосомные генетические структуры: строение, классификация, функции (плазмиды, транспозаны, Is-последовательности).

6.Молекулярно-биологические методы исследований в клинической практике.

Задания для выполнения лабораторной работы

1. Провести опыт по трансформации бактерий:

1)сделать смыв культуры сенной палочки (ауксотрофный штамм, нуждающийся в треонине) и разлить по 0,5 мл в две стерильные пробирки;

2)в первую пробирку добавить о,5 мл раствора ДНК прототрофного штамма, во вторую – 0,5 мл физиологического раствора, поставить в термостат на 30 мин;

3)произвести посев (по 0,1 мл) на чашки с минимальной средой;

4)по демонстрационным посевам учесть рост микробов, записать ре-

зультат.

Ауксотрофные штаммы микроорганизмов, в отличие от прототрофных, требуют наличия определенных питательных веществ в среде, поскольку сами их синтезировать не могут. На минимальной питательной среде они не растут.

57

На питательной среде, где сделан посев сенной палочки или ДНК, роста колоний не будет. В третьем секторе, если произошла трансформация и бактерии получили фрагмент ДНК с информацией о ферменте триптофансинтетазе, произойдет рост микроорганизмов.

2.Провести опыт по конъюгации бактерий:

1)сделать смыв культур E.coli тиминзависимого штамма (Hfr-клетки)

иштамма E.coli (F־), нуждающегося в лейцине;

2)по 0,5 мл суспензии каждого штамма смешать в отдельной пробирке и поставить в термостат на 30 мин;

3)произвести высев препарата на чашку с минимальной средой;

4)по демонстрационным посевам учесть и записать результаты опыта. Посев исходных штаммов микроорганизмов на минимальную пита-

тельную среду роста не дает, так как в ней нет необходимых аминокислот. Если произошла коньюгация, то при посеве смеси вырастут колонии кишечных палочек, получивших от Hfr-клеток фрагмент ДНК, ответственный за синтез лейцина и треонина.

3. Изучить методику постановки опыта по выявлению Col-плазмид. Исследования проводят методом отсроченного антагонизма по Фреде-

рику. Испытуемые культуры (например, шигеллы Зоне) засевают уколом в 1,5% мясопептонный агар по 4–5 штаммов на одну чашку Петри. После инкубирования в течение 24 ч при 37 оС выросшие макроколонии стерилизуют парами хлороформа. С этой целью чашку размещают вверх дном и на внутреннюю поверхность крышки наносят 4–6 капель хлороформа. Через 30 мин хлороформ удаляют, выдерживая чашки с открытой крышкой 15–20 мин. Затем поверхность агара заливают слоем расплавленного и охлажденного до 48 оС 0,7 % мясопептонного агара (5 мл), предварительно смешанного с 0,1 мл шестичасовой бульонной культуры индикаторного штамма (например, E.coli W1655). После суточной инкубации при 37 оС учитывают результат. Бактерии имеют Col-плазмиду (продуцируют колицин), если вокруг их макроколоний образовались зоны подавления роста индикаторной культуры на фоне ее роста сплошным газоном в остальных участках среды. Идентификацию вида Col-плазмид осуществляют этим же методом, используя коллекцию эталонных индикаторных культур с известной резистентностью или чувствительностью к колицинам.

Вопросы для обсуждения

1. Рекомбинация – обмен генетической информацией. 2. Типы рекомбинаций (общая, «незаконная», сайт-специфическая). 3. Основные механизмы трансформации. 4. Этапы обмена генетической информацией путем трансформации. 5. Основные механизмы коньюгации. 6. Роль полового фактора. 7. Понятие об F+-, F- и Hfr-клетках. 8. Типы передачи генетического материала в процессе коньюгации. 9. Механизмы трансдукции. 10. Роль умеренного бактериофага в процессе трансдукции. 11. Внехромосомные генетические элементы. 12. Строение и функции плазмид. 13. Строение и функции

58

транспозонов и Is-последовательностей. 14. Молекулярно-генетические методы исследований в клинической практике (гибридизационный анализ нуклеиновых кислот, методы амплификации). 15. Полимеразная цепная реакция. Принцип, виды, преимущества метода. 16. Устройство ПЦР–лаборатории.

Дополнительный материал

Молекулярно-генетический метод позволяет осуществлять раннюю и более полную диагностику различных заболеваний, своевременно проводить дифференциальную диагностику и осуществлять контроль эффективности терапии.

В настоящее время имеется два направления генетической диагности-

ки:

1 – гибридизационный анализ нуклеиновых кислот 2 – диагностика с использованием амплификации (полимеразная цеп-

ная реакция).

Гибридизационный анализ использует способность нуклеиновых кислот в определенных условиях образовывать специфические комплексы с нуклеиновыми же кислотами, имеющими комплементарные к ним последовательности. Метод детекции инфекционных возбудителей ДНКгибридизацией оказался крайне трудоемким, длительным и дорогостоящим.

Амплификация – многократное копирование определенного участка нуклеиновых кислот (ДНК, РНК через обратную транскриптазу) в процессе повторяющихся температурных циклов.

Существует большое количество методов амплификации нуклеиновых кислот. В настоящее время предложено подразделить все методы амплификации, в зависимости от технологии на три основные категории.

1.Метод ПЦР, самоподдерживающаяся реакция репликации последовательностей (3SR), амплификация с вытеснением цепи (АВЦ).

2.Амплификация с использованием QB-peпликазы, лигазная цепная реакция (ЛЦР).

3.Амплификация сигнала, при которой усиление сигнала каждой молекулы зонда происходит за счет использования сложных зондов, или технологии разветвленной ДНК.

Все методы амплификации могут быть разделены в зависимости от изменения температурных режимов на:

1) методы амплификации с циклической сменой температурных параметров (методы ПЦР, ЛЦР и их модификации);

2) изотермальные методы амплификации нуклеиновых кислот (метод изотермальной транскрипционной амплификации (TAS), самоподдерживающаяся репликация последовательностей (3SR, NASBA), амплификация с вытеснением цепи (АВЦ), амплификация с использованием QB-репликазы.

Этапы амплификации.

1.Подготовка исследуемого образца в целях выделения ДНК (РНК) из

клеток.

59

2.Непосредственная амплификация выделенных участков (копий) ДНК

(РНК).

3.Детекция продуктов, полученных на втором этапе.

Для детектирования микроорганизмов наиболее часто используется полимеразная цепная реакция – ПЦР (PCR – polymerase chain reaction).

Полимеразная цепная реакция – это метод, имитирующий естест-

венную репликацию ДНК, позволяющий обнаружить и многократно копировать с помощью термофильной ДНК-полимеразы определенный фрагмент ДНК. Суть метода заключается в многократном копировании (амплификации) в пробирке определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ДНК-полимеразой. Благодаря этому происходит многократное увеличение количества специфических фрагментов ДНК в миллионы раз, что значительно упрощает дальнейший анализ.

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты.

1.Анализируемый образец – это подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, служащий мишенью для последующего многократного копирования (например, кровь, потенциально содержащая ДНК микроорганизмов). При отсутствии ДНК-мишени специфический продукт амплификации не образуется.

2.Два праймера (соответствуют тому возбудителю, который хотим найти). Праймеры – синтетические олигонуклеотиды, состоящие из 15–30 нуклеотидов, комплементарных сайтам (участкам) на идентифициуемой матричной ДНК. Тем самым от исследователя зависит, какой участок генома будет копироваться. От правильности подбора праймеров зависит уровень амплификации ДНК.

3.Термостабильная ДНК-полимераза – фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов, – Thermus Aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие. Taq-полимераза выделена из водорослей Thermus Aquaticus, живущих в горячих источниках, обладает ДНК-полимеразной активностью. Несколько лет назад удалось получить из бактерий Thermus Thermophilis Tth-ДНК-полимеразу, которая выполняет целый ряд функций, в том числе обеспечивает репарацию и репликацию ДНК, обладает обратнотранскриптазной активностью, позволяя получать из РНК комплементарную ДНК.

4.Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) – «строительный материал», используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.

5.Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.

6.Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции – рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.

60