obschaya_mikrobiologia_metodicheskie_ukazania

бильной медицинской аппаратуры получило высокую оценку специалистов, применение этиленоксидной стерилизации позволяет обеспечить своевременную стерилизацию всего объема термолабильной аппаратуры и инструментария. Этиленоксидный метод обеспечивает самый щадящий температурный режим стерилизации.

2. Газовая стерилизация при помощи формальдегида.

Стерилизация термолабильных изделий формальдегидом стоит на втором месте после этиленоксида. Оптимальный диапазон температуры при формальдегидной стерилизации должен быть 60–80 º С, давление – от 0,25 до 0,475 бар, при концентрации формальдегида от 8 до 15 мг/л. Реально формальдегид используется в концентрации около 30 мг/л, экспозиция до 60 мин.; при этом общая продолжительность цикла составляет 3,5 ч (с учетом дегазации простерилизованных изделий – аэрации). Для стерилизации же он не является самым удачным выбором. Низкая проникающая способность формальдегида приводит к тому, что данный метод требует применения рабочей температуры в пределах 65–80 °С. Многие специалисты вообще не считают этот метод низкотемпературным. Для формальдегида имеются существенные ограничения в отношении стерилизации полых изделий, изделий с отверстиями и каналами. Весьма существенно, что для формальдегида не разработано нейтрализаторов и полного мониторинга процесса стерилизации. Не все изделия, стерилизуемые этиленоксидом, можно стерилизовать формальдегидом. Рекомендованное исключение составляют оптические инструменты, имплантируемые изделия, эндоскопическая аппаратура.

Стерилизация изделий растворами химических средств является вспомогательным методом, поскольку изделия нельзя простерилизовать в упаковке. По окончании стерилизации их необходимо промыть стерильной жидкостью (питьевая вода, 0,9% раствор натрия хлорида), что при нарушении правил асептики может привести к вторичному обсеменению простерилизованных изделий микроорганизмами. Данный метод следует применять для стерилизации изделий, в конструкцию которых входят термолабильные материалы, и их особенности не позволяют использовать другие официально рекомендуемые методы стерилизации. Конструкция изделия должна позволять стерилизовать его растворами химических средств. При этом необходим хороший доступ стерилизующего средства и промывной жидкости ко всем стерилизуемым поверхностям изделия.

Стерилизующие средства: перекись водорода, Дезоксон-1, Дезоксон-4, Первомур, Лизоформин-3000, Сайдекс, Дюльбак растворимый ("Петтенс- Франс-Химия",Франция), Гигасепт ФФ ("Шюльке и Майр", Германия).

Плазменная стерилизация

Этот метод основан на действии плазмы перекиси водорода (Н2О2). Плазма – четвертое состояние вещества (в отличие от твердого, жидкого и газообразного). Она состоит из ионов, электронов, нейтральных атомов и молекул, образуется под действием внешних источников энергии, таких как температура, радиационное излучение, электрическое поле и др. При этом

41

методе после впрыскивания раствора перекиси водорода в стерилизационную камеру включается источник электромагнитного излучения частотой 13,56 МГц, под воздействием которого одновременно происходит деление одной части молекул Н2О2 на две группы (ОН–), а другой части – на одну гидропероксильную группу (ООН–) и один атом водорода, сопровождающееся выделением видимого и ультрафиолетового излучения. В результате создается биоцидная среда, состоящая из молекул перекиси водорода, свободных радикалов и ультрафиолетового излучения. При отключении электромагнитного поля свободные радикалы преобразуются в молекулы воды и кислорода, не оставляя никаких токсичных отходов. Сте-

рилизация проводится при температуре 46–50 ºС за 54–72 мин. На сегодняшний день отсутствуют общепризнанные международные стандарты для данного метода. Имеются определенные ограничения в отношении стерилизации материалов, содержащих целлюлозу и каучук.

Озоновая стерилизация

Один из самых высоких потенциалов окисления имеет озон. Именно поэтому он уже давно привлекает внимание специалистов, занимающихся проблемами стерилизации. В течение многих лет озон используется для обеззараживания питьевой воды и воздуха, и лишь только недавно он был предложен для стерилизации в медицине. Стерилизация производится озоно-

воздушной смесью, продуцируемой генератором озона из атмосферного воздуха. Однако окислительная способность озона и ограничивает его спектр применения. При контакте с ним могут повреждаться изделия из стали, меди, резины и др. Кроме того, озон токсичен, а имеющиеся сегодня аппараты не позволяют

обезопасить персонал от контакта с ним. Немаловажным обстоятельством является то, что повторяемость метода до сих пор под вопросом. Для контролирования процесса существуют только индикаторы первого класса (свидетели процесса).

Радиационная стерилизация

Стерилизующим агентом при радиационной стерилизации является проникающее гаммаили бета-излучение. Наиболее широко используется гамма-излучающий изотоп кобальта-60, реже изотоп цезия-137, в связи с его низким уровнем энергии и излучения. Эффективность радиационной стерилизации зависит от общей дозы излучения и не зависит от времени. Доза 25 кГр (2,5 Мрад) надежно гарантирует уничтожение высокорезистентных споровых форм микроорганизмов.

42

Радиационная стерилизация обладает рядом технологических преимуществ: высокая степень инактивации микроорганизмов, возможность стерилизации больших партий материалов, автоматизация процесса, возможность стерилизации материалов в любой герметичной упаковке (кроме радионепрозрачной). Немаловажным обстоятельством является то, что температура стерилизуемых изделий в ходе стерилизации не повышается. Радиационный метод используется для промышленной стерилизации одноразовых изделий из полимерных материалов, режущих инструментов, шовного и перевязочного ма-

териала, некоторых лекарственных препаратов. В лечебно-профилактических учреждениях радиационная стерилизация не применяется в связи с большой дороговизной установок и по соображениям техники безопасности.

МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ СТЕРИЛИЗАЦИИ

В комплексе мероприятий по стерилизации изделий медицинского назначения важное значение имеет организация и проведение контроля за ее эффективностью. Используемые до настоящего времени методы и средства контроля не всегда позволяют выявить дефекты стерилизации, что влечет за собой повышение уровня внутрибольничных инфекций.

Контроль эффективности работы стерилизационного оборудования осуществляется физическими, химическими и биологическим (бактериологическим) методами. Надежность этих методов неодинакова. Физические и химические методы предназначены для оперативного контроля и позволяют контролировать соблюдение параметров режимов паровой, газовой, воздушной стерилизации: температуру, давление, экспозицию. Недостаток этих методов заключается в том, что они не могут служить доказательством эффективной стерилизации. Достоверным для определения эффективности является только бактериологический метод.

1. Физические методы

Физические методы контроля осуществляются с помощью средств измерения температуры (термометры, термопары), давления (манометры, мановакуумметры) и времени (таймеры). Современные стерилизаторы оснащены также записывающими устройствами, фиксирующими отдельные параметры каждого цикла стерилизации.

2. Химические методы

В течение десятков лет для проведения химического контроля применялись химические вещества, изменяющие свое агрегатное состояние или цвет при температуре, близкой к температуре стерилизации (бензойная кислота для контроля паровой стерилизации, сахароза, гидрохинон и ряд других веществ – для контроля воздушной стерилизации). При изменении цвета

43

и расплавлении указанных веществ результат стерилизации признавался удовлетворительным. Однако многолетние наблюдения и данные литературы указывают, что при удовлетворительных результатах химического контроля с помощью названных индикаторов, бактериологический контроль в ряде случаев (до 12 %) выявляет неудовлетворительный результат стерилизации.

Принимая во внимание недостаточную достоверность использования указанных индикаторов для контроля, а также значительную трудоемкость и неудобство их практического применения, были разработаны химические индикаторы, изменение цвета которых происходит при воздействии температуры, принятой для данного режима, в течение времени, необходимого для стерилизации. По изменению окраски этих индикаторов можно судить о том, что основные параметры процесса стерилизации – температура и время – выдержаны. Длительное применение таких индикаторов показало их высокую надежность.

Более сложные индикаторы предназначены для контроля критических параметров процесса стерилизации. Критическими параметрами являются:

для парового метода стерилизации – температура, время воздействия данной температуры, водяной насыщенный пар; для воздушного метода стерилизации – температура и время воздействия данной температуры; для газовых методов стерилизации – концентрация используемого газа, температура, время воздействия, уровень относительной влажности; для радиационной стерилизации – полная поглощенная доза.

С января 2002 года в России введен в действие ГОСТ Р ИСО 11140–1 "Стерилизация медицинской продукции. Химические индикаторы. Общие требования". Согласно этому документу химические индикаторы распределены на шесть классов.

Индикаторы 1-го класса являются индикато-

рами ("свидетелями") процесса. Примером такого индикатора является термоиндикаторная лента,

наклеиваемая перед проведением стерилизации на текстильные упаковки или стерилизационные коробки. Изменение цвета ленты указывает, что упаковка подверглась воздействию процесса стерилизации. Такие же индикаторы могут помещаться в наборы хирургических инструментов или операционного белья.

2-й класс индикаторов предназначен для использования в специальных тестовых процедурах, например, при проведении теста Бовье-Дика (Bowie-Dick test). Этот тест не контролирует параметры стерилизации, он оценивает эффективность удаления воздуха из камеры парового стерилизато-

ра.

Индикатор теста представляет собой лист бумаги с нанесенным на него сложным рисунком из химического состава, изменяющего свой цвет под воздействием насыщенного водяного пара. Лист

44

размещается внутри стопки текстильных изделий при проведении стандартного цикла стерилизации. Сейчас выпускаются так называемые "пакеты Бо- вье-Дика", в которых контрольный лист размещен между листами плотной фильтровальной бумаги, имитирующей стопку текстиля. Такие пакеты можно использовать при пустой камере стерилизатора или вместе со стерилизуемым, например, инструментарием.

Неудачный результат проявляется более светлым цветом в центре образца чем по краям, либо неравномерным изменением цвета рисунка. Положительным результат считается при однородном изменении цвета рисунка по всему листу индикатора.

Индикаторы 3-го класса являются индикаторами одного параметра. Они оценивают максимальную температуру, но не дают представления о времени ее воздействия. Примерами такого рода индикаторов являются описанные выше химические вещества. Термохимический индикатор представляет собой полоску бумаги, на которую нанесена термоиндикаторная краска. Определение параметров, достигнутых в процессе стерилизации, основано на изменении цвета термоиндикаторной краски при достижении "температуры перехода", стро-

го определенной для каждой краски.

Такие индикаторы применяются для контроля воздушной стерилиза-

ции.

4-й класс – это многопараметровые индикаторы. Они содержат красители, изменяющие свой цвет при сочетанном воздействии нескольких параметров стерилизации, чаще всего - температуры и времени. Примером та-

ких индикаторов служат термовременные индикаторы

для контроля воздушной стерилизации.

5-й класс – интегрирующие индикаторы. Эти индикаторы реагируют на все критические параметры метода стерилизации. Характеристика этого класса индикаторов сравнивается с инактивацией высоко-

резистентных микроорганизмов.

6-й класс – индикаторы-эмуляторы. Эти индикаторы должны реагировать на все контрольные значения критических параметров метода стерилизации.

3. Биологический метод

Наряду с физическими и химическими применяется бактериологический метод контроля стерилизации. Он предназначается для контроля эффективности стерилизационного оборудования. До недавнего времени для контроля паровой и воздушной стерилизации использовались пробы садовой земли, содержащей микроорганизмы, высокорезистентные к воздействию стерилизующих факторов. Однако устойчивость микроорганизмов в различных пробах неодинакова, что не позволяет стандартизировать результаты контроля.

45

В настоящее время для проведения бактериологического контроля используются биотесты, имеющие дозированное количество спор тесткультуры. Контроль эффективности стерилизации с помощью биотестов рекомендуется проводить 1 раз в 2 недели. В зарубежной практике принято применять биологическое тестирование не реже 1 раза в неделю.

ЗАНЯТИЕ 7

Тема: ДЫХАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ. ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ АНАЭРОБОВ. РОСТ И РАЗМНОЖЕНИЕ МИКРОБОВ.

ДЕЗИНФЕКЦИЯ

Цель занятия: изучить морфологию анаэробов, освоить методы культивирования анаэробов и методы выделения чистой культуры анаэробов; продолжить выделение чистой культуры аэробов (3-й день).

План занятия

1.Дыхание микроорганизмов. Типы дыхания. Процесс брожения.

2.Методы культивирования анаэробов.

3.Методы выделения чистой культуры анаэробов.

4.Рост и размножение микробов.

5.Понятие о дезинфекции.

Задания для выполнения лабораторной работы

1.Продолжить выделение чистой культуры аэробов (3-й день): а) сделать мазок посева на скошенном агаре, окрасить по Граму, изучить под микроскопом для проверки чистоты выделенной культуры; б) для изучения биохимических свойств выделенной культуры сделать посев на ряд Гисса и МПБ.

2.По демонстрационному материалу познакомиться с морфологией анаэробов – возбудителей столбняка, ботулизма и газовой гангрены. Зарисовать микропрепараты.

3.Познакомиться с методами культивирования анаэробов. По демонстрационным материалам описать характер роста микроорганизмов при посеве уколом в столбик. Записать в практическую тетрадь.

Особенности роста микроорганизмов по ходу укола в столбик пи-

тательной среды. В верхней части растут аэробы, в нижней – анаэробы. Стержень: длинный, короткий, в виде плоской ленты и т.д. Боковые отростки: длинные, короткие, в виде ершика, елочки, елочки вершиной вниз и т.д. Разжижение среды: не разжижает, разжижает полностью, послойно, во-

46

ронкой, кратером и т.д. Газообразование: наличие или отсутствие пузырьков газа.

Необходимым условием культивирования анаэробных бактерий является создание анаэробных условий, что достигается с помощью физических, химических, биологических и смешанных методов.

Физические методы

1. Кипячение среды – наиболее простой способ удаления растворенного кислорода. Непосредственно перед посевом материала пробирки с жидкими питательными средами кипятят на водяной бане в течение 15–20 мин. При кипячении из среды вытесняется воздух и, следовательно, удаляется кислород. Среду быстро охлаждают, чтобы не дать ей насытиться кислородом воздуха, и используют для посева. Для уменьшения диффузии кислорода из воздуха питательные среды заливают сверху стерильным вазелиновым или парафиновым маслом (толщина слоя 1,0–1,5 см). Засев среды проводят пипеткой сквозь масло в наклонном положении пробирки.

2.Посев уколом в столбик питательной среды. Пробирку с питатель-

ной средой, застывшей в виде столбика, берут в левую руку и в центр столбика до дна пробирки вкалывают петлю с находящимся на ней материалом. Пробирку закрывают пробкой, в верхней третьей части подписывают. В штативах помещают в термостат для инкубирования.

3.Эвакуационно-заместительный метод заключается в удалении воз-

духа из анаэростатов, анаэробных боксов с помощью вакуумного насоса с последующей заменой его инертным газом (азот, аргон, гелий). Анаэростат представляет собой толстостенный металлический цилиндр с герметически привинчивающейся крышкой, на которой имеются вакуумметр и два крана для присоединения к вакуум-насосу. В прибор помещают чашки с посевами, откачивают воздух, кран закрывают, ставят в термостат для культивирования анаэробов при определенной температуре. Для поглощения водных паров на дно анаэростата помещают 5–6 г хлористого кальция, 10–12 г силикогеля или 20–30 г хлористого натрия. Анаэробные условия в микроанаэростате могут быть созданы и при использовании коммерческих газогенерирующих паке-

тов для анаэробов (BioMerioux; Becton Dickinson).

4.Метод Вейон-Виньяля. В узкую стеклянную пипетку заливают расплавленный агар, смешанный с исследуемой микробной культурой. После чего пипетку запаивают с обоих концов парафином. Пипетку инкубируют одни сутки в термостате при температуре 37 ºС. В расплавленном агаре микробная масса распределяется равномерно и по истечении времени инкубации образуются хорошо видимые на просвет изолированные колонии микроорганизмов. Пипетку просматривают, после чего производят распил пипетки в месте локализации отдельных колоний и забирают их бактериологической петлей для идентификации.

Химические методы

1. Метод Аристовского. Материал, исследуемый на наличие анаэробов, засевают на среду в чашки Петри, после чего помещают их в эксикатор. На дно эксикатора кладут химический поглотитель кислорода: гидросульфат

47

натрия или пирогаллол (для поглощения кислорода из 220 мл воздуха применяют смесь, состоящую из 1 мл 20% раствора пирогаллола и 1 мл насыщенного раствора карбоната натрия – Na2CO3. В расширенную часть сосуда устанавливают на подставке чашки с посевами. Прибор помещают в термостат при температуре 37 ºС на 24–48 ч.

2. Применение редуцирующих веществ. Для связывания остатков ки-

слорода в предназначенных для роста анаэробов питательных средах используют вещества-редуценты, к которым относятся тиогликолевая кислота, тиогликолят натрия (0,01–0,02%), аскорбиновая кислота (0,1%), различные сахара (0,1–3%), цистин и цистеин (0,03–0,05%), муравьинокислый натрий

(0,25–0,75%) и др.

Биологические методы

1.Метод Фортнера – совместное выращивание анаэробов и аэробов. На одну половину чашки Петри засевают исследуемый материал, а на другую – культуру аэробного микроорганизма, способного энергично поглощать кислород. После посева чашку закрывают крышкой, края которой заливают парафином.

2.Помещение в питательную среду кусочков печени, головного мозга, почек и других внутренних органов. При этом тканевые клетки активно поглощают кислород, в результате в среде создаются анаэробные условия.

Для предотвращения попадания кислорода сосуды с питательными средами закрывают резиновыми пробками.

Среда Китта–Тароцци (МПБ) используется для культивирования анаэробов. В ее состав входят мясо-пептонный бульон, 0,5 % натрия хлорида, кусочки печени или мышц для адсорбции кислорода. Устанавливают рН 7,6– 7,8. На поверхность среды тонким слоем наслаивают вазелиновое масло.

Методы выделения чистой культуры анаэробов

1.Метод Цейсселера. Исследуемый материал засевают штрихами последовательно на три чашки Петри по поверхности плотной питательной среды, помещают в анаэробные условия и культивируют в термостате при 37 °С в течение 24–72 ч. Изолированные колонии анаэробов пересевают в среду для контроля стерильности (СКС) или среду Китта–Тароцци.

2.Метод Вейнберга. Несколько капель исследуемого материала вносят в пробирку с 4–5 мл раствора хлористого натрия, перемешивают и переносят в пробирку с охлажденным до 45–50°С полужидким сахарным агаром, разлитым высоким столбиком. После перемешивания последовательно засевают еще в четыре пробирки с сахарным агаром и быстро охлаждают под струей холодной воды. Выросшие через 24–72 ч в глубине агара изолированные колонии анаэробов засевают в среду Китта–Тароцци.

Многократный перенос петли с материалом по вышеуказанным методам повышает степень разобщения микробов и вероятность роста их колоний

впоследней пробирке или чашке Петри.

3.Метод Перетца. Готовят разведения исследуемого материала как указано выше. Содержимое пробирки с соответствующим разведением выли-

48

вают в стерильную чашку Петри, на дне которой на двух стеклянных или деревянных палочках лежит стеклянная пластинка размером 6х6 см. Среду заливают таким образом, чтобы она заполнила пространство между пластинкой и дном чашки Петри. При появлении микробного роста стеклянную пластинку удаляют, а изолированные колонии засевают в пробирку со средой КиттаТароцци для получения чистой культуры.

Вопросы для обсуждения.

1. Дыхание микроорганизмов. 2. Типы дыхания микробов. 3. Пути получения энергии микроорганизмами. 4. Процесс окислительного фосфорилирования у микроорганизмов с аэробным типом дыхания. 5. Процесс субстратного фосфорилирования у микробов с анаэробным типом дыхания. 6. Процесс брожения, типы. 7. Физические методы создания условия для культивирования анаэробов. 8. Химические методы создания анаэробных условий. 9. Биологические методы создания анаэробных условий.10. Методы выделения чистой культуры анаэробов: Цейселера, Вейнберга, Перетца. 11. Рост и размножение микроорганизмов. 12. Понятие о дезинфекции. 13. Виды дезинфекции в зависимости от вида предмета медицинского назначения и цели его применения. 13. Основные классы дезинфицирующих средств с указанием современных форм. 14. Аппаратная дезинфекция.

Дополнительный материал

2.Облигатные анаэробные бактерии собираются в нижней части, чтобы избежать кислорода (либо не дают роста).

3.Факультативные бактерии собираются в основном в верхнем (окислительное фосфорилирование является наиболее выгодным, чем гликолиз), однако они могут быть найдены на всем протяжении среды, так как не зависят

от O2.

4.Микроаэрофилы собираются в верхней части пробирки, но их оптимум — малая концентрация кислорода.

5.Аэротолерантные анаэробы не реагируют на концентрации кислорода и равномерно распределяются по пробирке.

49

Число

бактерий

Время

Рис. 10.Фазы роста микробной популяции: I – исходная фаза; II – фаза ускорения роста; III – фаза логарифмического роста; IV – фаза замедления роста; V – стационарная фаза; VI – фаза ускорения гибели; VII – фаза логарифмической гибели; VIII – фаза замедления гибели; IX – фаза гибели или спорообразования

Дезинфекция – это методы и средства уничтожения болезнетворных микроорганизмов на путях передачи от источника инфекции к здоровому организму. Основная задача дезинфекции – прерывание механизма передачи инфекции обеззараживанием различных объектов (вода, поверхности объектов, пищевые продукты, предметы бытовой обстановки и др.). Следует подчеркнуть, что дезинфекция – это уничтожение не всей микрофлоры, населяющей обрабатываемый объект, а в идеале только болезнетворных микробов.

Выделяют следующие виды дезинфекции:

1 – механическую,

2 – физическую,

3 – химическую.

1.Механический способ дезинфекции предполагает влажную уборку помещений, мытье, стирку, вытряхивание и выколачивание. Сюда же относится фильтрация воздуха и воды, заключающаяся в очистке их от посторонних частиц, в том числе и микробов. Механический способ не приводит к полному освобождению от микробов, поэтому его обычно сочетают с физическим и химическим способами.

2.Физический способ дезинфекции – кипячение, обработка паром и го-

рячим воздухом, а также ультрафиолетовое облучение. Дезинфекция лучше всего достигается при кипячении (100 ºС, не менее 10 мин), которое убивает все микроорганизмы за исключением некоторых бактериальных спор. Кипячение используется для обработки белья (кипятят в мыльно-содовом растворе в течение 2 ч), посуды (в 2 % содовом растворе в течение 15 мин), питьевой воды, игрушек, остатков пищи. Паровоздушная смесь используется в дезинфекционных камерах, где обеззараживают вещи и постельные принадлежности. Ультрафиолетовое облучение используется для обеззараживания воздуха помещений.

3.Химический способ дезинфекции состоит в применении химических средств, губительно действующих на возбудителей инфекционных заболева-

50