obschaya_mikrobiologia_metodicheskie_ukazania

Дополнительный материал

ГРИБЫ (ЦАРСТВО FUNGI)

ДИМОРФНЫЕ – способны к гифальному и дрожжеподобному росту в зависимости от температуры (при температуре ниже 37º С образуют псевдомицелий, 37º С и выше

– дрожжеподобные клетки)

Рис. 5. Морфологическая классификация микроскопических грибов

Размножение:

1 – половое: образуются гаметы, половые споры. Половые формы называют-

ся телеоморфами.

2 – бесполое: с помощью почкования, бесполыми спорами. Такие формы на-

зываются анаморфами.

21

А Б В А – Mucor, Б - Aspergillus, B – Penicillium.

Рис. 6. Формы спорообразования у грибов

Основные типы конидий:

1 – артроконидии или таллоконидии: образуются путем равномерного септирования или расчленения гиф;

2– бластоконидии: образуются в результате почкования;

3– микроконидии: одноклеточные небольшие конидии;

4– макроконидии: многоклеточные большие конидии;

22

5 – хламидоконидии: бесполые конидии или хламидоспоры (толстостенные крупные покоящиеся клетки или комплекс мелких клеток); 6 – склероции: твердая масса клеток с оболочкой (покоящиеся органы

грибов, способствующие их выживанию в неблагоприятных условиях).

Наибольшее медицинское значение имеет род Candida, включающий более 200 видов. По данным на сегодняшний день, заболевания у человека кандидозом вызывают около 20 видов грибов рода Candida.

Семейство: Cryptococcaceae Род: Candida

Виды: C. аlbicans, С. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata, C. krusei

Возбудители кандидозов представляют собой гетерогенную группу дрожжеподобных грибов, часть которых не способна к половому размножению и может быть отнесена к дейтеромицетам. Являясь дрожжеподобными, имеют две фазы – дрожжевую и мицелярную.

Дрожжевая фаза представлена овальными или круглыми бластоспорами (клетки споры), размножающимися многополюсным почкованием. Мицелярная фаза – нити из удлиненных клеток, образующих псевдомицелий. От истинного отличается отсутствием общей клеточной стенки и перегородок. На перетяжках псевдомицелия располагаются бластоспоры. На терминальных расширениях образуются хламидиоспоры – споры с двойной обо-

лочкой, превосходят псевдомицелий по размеру. Хорошо хламидоспоры образуются на картофельном агаре при добавлении в среду 2% глюкозы.

Но кандиды не являются истинными диморфными грибами. У истинных диморфных грибов чередование фаз связано с температурным фактором: при температуре ниже 370 С образуется псевдомицелий, при 370 С и выше – дрожжеподобные клетки. Кандиды в инфицированном организме можно обнаружить как в виде дрожжеподобных клеток, так и при прорастании в ткани организма в виде псевдомицелия.

Принадлежность к роду Candida устанавливается по наличию псевдомицелия и хламидиоспор в мазках, типичных форм.

Рис. 7. Структура C. аlbicans (Воробьев А. А.)

Строение. Кандиды имеют строение, типичное для всех эукариотических клеток: в цитоплазме присутствуют рибосомы, митохондрии, включения в виде гликогена, крупное ядро, ограниченное ядерной мембраной, аппарат Гольджи, эндоплазматическая сеть.

23

Цитоплазматическая мембрана кандид содержит высокий процент эргостерола и систему энзимов, обеспечивающих его биосинтез. Это химическое своеобразие позволяет использовать мембрану как мишень для анти-

фунгальной терапии.

Клеточная стенка является существенной структурой, обеспечивающей жизнедеятельность кандид, в частности, С. аlbicans, и ее взаимодействие с тканями хозяина. Она состоит в основном из углеводов (80-90%), которые представлены бета-глюканом, хитином и маннаном. Компоненты клеточной стенки дрожжевой и гифальной форм сходны по химическому составу, хотя имеют некоторые количественные вариации. Бета-глюкан – является главным компонентом клеточной стенки (от 47 до 60 % сухой массы). В свою очередь, хитин (неветвящийся полимер N-ацетилглюкозамина) является минорной составляющей клеточной стенки (от 1 до 10 % сухой массы) и присутствует главным образом в гифальной форме кандид (примерно в 3 раза больше, чем в дрожжевой форме). Эти два микрофибриллярных полисахарида более сконцентрированы вблизи плазматической мембраны, обеспечивая ригидность каркаса. Следующим важным компонентом клеточной стенки является маннан (до 40 % сухого вещества клеточной стенки). Он состоит из полимеров маннозы, которая может быть ковалентно связана с различными белками через гликозидную связь.

хитин глюканы

маннанопротеины

Ц

П

М

Рис. 8. Схема строения клеточной стенки С. аlbicans

Все полисахариды клеточной стенки связаны с белками. Они располагаются между мананом и глюканом и представлены периферическими белками. Чаще это ферментные белки: инвертазы, кислые фосфатазы, аминопептидазы, образующие на поверхности клеточной стенки осмиофильный белковый слой. У кандид на поверхности располагаются и липиды, повышающие осмиофильность, а также фимбрии, содержащие высокогликозилированный гликопротеин.

Тинкториальные свойства. Грибы рода кандида легко окрашиваются: простыми методами (метиленовым синим), по методу Грама (грамположительные), по методу Романовского–Гимзы (ядро – красное, цитоплазма – голубая).

Можно микроскопировать и неокрашенные грибы (метод «раздавленной капли»).

24

Тип дыхания. Кандиды являются аэробами. Способны метаболизировать глюкозу по гексозомонофосфатному пути или по пути Эмбдена– Мейергофа–Парнаса (гликолиз). Другие метаболические механизмы, такие как митохондриальное окислительное фосфорилирование, цитратный цикл и синтез белка на рибосомах, не отличаются от таковых в других эукариотических организмах.

ЗАНЯТИЕ 5

Тема: ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ. МЕТАБОЛИЗМ И ПИТАНИЕ МИКРОБОВ. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Цель занятия: познакомиться с питательными средами, освоить технику приготовления питательных сред, методы посева микробов на жидкие и твердые питательные среды; изучить этапы выделения чистой культуры аэробов и выделить чистую культуру.

План занятия

1.Химический состав микробной клетки.

2.Катаболизм и анаболизм как составные части процесса метаболизма.

3.Источники питания для микроорганизмов. Типы питания микроорганизмов.

4.Транспорт питательных веществ в микробную клетку: пассивный (пассивная и облегченная диффузия), активный, транслокация химических групп.

5.Питательные среды, их классификация, характеристика, этапы приготовления, контроль готовых сред. Требования, предъявляемые к питательным средам.

6.Бактериологический метод изучения микроорганизмов. Понятие о чистой культуре микроорганизмов. Схема ее выделения.

Задания для выполнения лабораторной работы

1. Познакомиться с питательными средами. Записать схему их классификации по происхождению, консистенции, назначению.

Этапы приготовления питательных сред

а) Варка (согласно прописи питательной среды в дистиллированную воду вносят необходимые компоненты и растворяют при нагревании); б) установление рН с помощью потенциометра с учетом того, что после стерилизации рН среды снизится на 0,2 (для подщелачивания используют 0,1 н раствор NaOH, для подкисления - 0,1 н раствор HCI); в) осветление среды с помощью яичного белка, лошадиной сыворотки или путем отстаивания (осажде-

25

ния); г) фильтрация через фильтровальную бумагу (жидкие среды) или ват- но-марлевые фильтры (агаровые среды); д) разливка питательных сред; е) стерилизация; ж) контроль готовых сред (стерильности, химический, биологический).

Контроль режима стерилизации осуществляется с помощью химических термотестов и искусственных биотестов. Химические термотесты представляют собой вещества, изменяющие свой цвет или физическое состояние при стерилизации и имеющие различную температуру плавления. Запаянные ампулы с порошком, смешанным с красителем, помещают в стерилизационную камеру. При достижении в камере определенной температуры порошок плавится, образуя сплав, окрашенный в цвет добавленного красителя.

Бактериологический контроль режима стерилизации заключается в том, что в стерилизационную камеру помещают искусственные биотипы – пробирки с полосками марли или фильтровальной бумаги, зараженными микроорганизмами с известной устойчивостью к температурным воздействиям.

2. Ознакомиться с методами и техникой посева на жидкие и плотные питательные среды.

Техника посевов и пересевов культур микроорганизмов. Уни-

версальным инструментом для производства посевов является бактериологическая петля (металлическая многоразовая или пластмассовая одноразовая). Кроме нее, для посева уколом применяют специальную бактериологическую иглу, а для посевов на чашки Петри – металлические, стеклянные или пластиковые шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей используют пастеровские и градуированные пипетки.

Все манипуляции с микробами осуществляют с помощью стерильных инструментов вблизи пламени горелки. Металлическую бакте-

риологическую петлю перед использованием, после каждой манипуляции и по окончании работы стерилизуют путем прокаливания в пламени горелки.

Культивирование микробов осуществляют посевом их на питательные среды с последующей инкубацией в оптимальных условиях температуры, влажности, газового состава атмосферы и т.д. С этой целью материал, содержащий микроорганизмы (материал от больного, из чистой культуры, из изолированной колонии и т.д.), помещают (засевают) в жидкие или на плотные среды. В последнем случае посев может быть произведен как на поверхность, так и в глубину агара уколом. Предварительно посуду (пробирку, чашки Петри и др.) надписывают, указывая дату посева и характер посевного материала (номер исследования или название культуры).

В зависимости от техники посева и концентрации микробов в

посевном материале бактерии на поверхности плотной питательной среды могут давать равномерный сплошной рост – бактериальный газон, "сливной рост" (возникает при помещении большого количества микроорганизмов на ограниченный участок поверхности агара) или образовы-

вать изолированные колонии.

26

Посев на плотные питательные среды. Плотные питательные среды используют для посева материала на их поверхность и в толщу среды.

Посев петлей на среду в чашку Петри. Заранее подписанную чашку Петри с агаровой средой приоткрывают под углом во избежание попадания микробов извне. Бактериологическую петлю кладут плашмя на питательную среду, чтобы не поцарапать ее поверхность, и проводят штрихи по всей среде.

Штрихи, наносимые петлей, должны располагаться как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет общую линию посева и дает возможность получить на поверхности среды изолированные колонии микробов.

Окончив посев, петлю фламбируют, чтобы уничтожить оставшихся на ней микроорганизмов, и ставят в штатив. Пробирку закрывают, предварительно обеззаразив ее края и ту часть пробки, которая входит в горлышко пробирки.

Чашку Петри с посевами переворачивают вверх дном, во избежание размыва колонии конденсационной водой, и ставят в термостат для культивирования.

Посев шпателем на среду в чашку Петри. Исследуемую микробную культуру наносят на поверхность питательной среды у края чашки. Стерильным шпателем распределяют ее равномерно по всей поверхности. Чашку подписывают, переворачивают вверх дном и помещают в термостат для выращивания.

При обилии в засеваемом материале микробов они растут в виде пленки, покрывающей всю поверхность питательной среды. Такой характер микробного роста получил название сплошного или газонного. Посев газоном производят в том случае, когда нужно получить большие количества микробной культуры одного вида.

Посев в жидкую питательную среду. При посеве в жидкую питатель-

ную среду обе пробирки (одна с исследуемой культурой, другая с питательной средой) берут в левую руку между большим и указательным пальцами так, чтобы их основания находились поверх кисти руки. Все действия проводят над пламенем горелки (радиус 10–15 см). Пробки из пробирок вынимают мизинцем и безымянным пальцами правой руки, не прикасаясь к той части пробки, которая входит внутрь пробирки. Края пробирок при вынимании пробок прожигают. Остальные три пальца правой руки остаются свободными для взятия петли или пипетки, посредством которых материал переносят из одной пробирки в другую и распределяют в питательной среде. Бактериальную петлю прокаливают на огне непосредственно перед взятием материала. Чтобы остудить горячую петлю, ее вводят в глубь пробирки и погружают в конденсационную жидкость. При взятии петлей материала для посева должна образоваться в кольце петли тонкая прозрачная пленка – “зеркальце”. Петлю с находящимся на ней материалом погружают в питательную среду. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке пробирки и смывают жидкой средой. Пробирки закрывают пробками, предварительно профламбировав их края. Петлю обеззараживают и ставят в штатив.

27

Пробирку с посевами подписывают и помещают в термостат для культивирования.

3. Изучить этапы выделения чистой культуры микробов. Культивирование бактерий применяют, в частности, для выделения и

идентификации чистых культур.

Чистой культурой называется популяция бактерий одного вида или одной разновидности, выращенная на питательной среде. Примером чистой культуры может служить изолированная колония.

Колония представляет собой видимое изолированное сообщество микроорганизмов одного вида, образующееся в результате размножения одной бактериальной клетки на плотной питательной среде (на поверхности или в глубине ее).

Схема выделения и идентификации чистой культуры бактерий

Исследуемый материал

Идентификацию чистой культуры проводят по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим свойствам, антигенной структуре, факторам патогенности, чувствительности к бактериофагам (фаготипирование) и антибиотикам. Многие виды бактерий подразделяют по одному признаку на биологические варианты – биовары. Биовары, различающиеся по биохимическим свойствам, называют хемоварами, по антигенным свойствам – сероварами, по чувствительности к фагу – фаговарами и т.д. Культуры микроорганизмов одного и того же вида или биовара, выделенные из различных источников либо в разное время из одного и того же источника, называют штаммами, которые обычно обозначают номерами или какими-либо символами.

4-й день Учет результатов и выдача заключения по данным исследования

Примечание: при наличии небольшого числа микробов в исследуемом материале предварительно производят посев на среды обогащения. Некоторые микробы (пневмококки, возбудители туляремии) сначала вводят в организм восприимчивых животных (биологическая проба), затем выделяют чистую культуру.

4. Приступить к выделению чистой культуры (1-й день), зарисовать мазок, записать ход исследования.

28

Вопросы для обсуждения

1. Химический состав микробной клетки. 2. Функции соединений, вхо-

5. Источники питания для микроорганизмов. 6. Типы питания микроорганизмов. 7. Классификация микробов по способам питания.8. Транспорт питательных веществ в клетку микроорганизмов, транспортные системы. 9. Пассивный транспорт (пассивная и облегченная диффузия). 10. Активный транспорт питательных веществ, транслокация химических групп. 11. Классификация питательных сред по происхождению, консистенции, назначению. 12. Этапы приготовления питательных сред. 13. Контроль готовых сред. 14. Требования, предъявляемые к питательным средам. 15. Бактериологический метод исследования в микробиологии. 16. Этапы выделения чистой культуры микробов.

Оформление лабораторной тетради

Записать классификацию питательных сред; зарисовать схему выделения чистой культуры микроорганизмов по этапам; записать ход исследования по выделению чистой культуры (1-й день), зарисовать мазок.

Дополнительный материал

Требования, предъявляемые к питательным средам.

Для обеспечения разнообразных типов метаболизма микроорганизмов питательные среды должны соответствовать следующим требованиям.

1.Содержать воду, так как все процессы жизнедеятельности бактерий протекают в воде.

2.Для культивирования гетероорганотрофных бактерий в среде дол-

жен содержаться органический источник углерода и энергии. Эту функцию выполняют различные органические соединения: углеводы, аминокислоты, органические кислоты, липиды. Наибольшим энергетическим потенциалом обладает глюкоза, так как она непосредственно подвергается расщеплению с образованием АТФ и ингредиентов для биосинтетических путей. Часто используется в этих целях пептон – продукт неполного гидролиза белков, состоящий из поли-, олиго- и дипептидов. Пептон также поставляет аминокислоты для построения бактериальных белков.

3.Для синтеза белков, нуклеотидов, АТФ, коферментов бактериям требуются источники азота, серы, фосфаты и другие минеральные вещества, в том числе микроэлементы. Источником азота может служить пептон. Кроме того, большинство бактерий способны использовать соли аммония в качестве источника азота. Серу и фосфор бактерии способны утилизиро-

вать в виде неорганических солей: сульфатов и фосфатов. Для нормального функционирования ферментов бактериям требуются ионы Са2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, которые добавляют в питательную среду в виде солей, чаще всего фосфатов.

29

4. Решающее значение для роста многих микроорганизмов имеет рН среды. Поддерживание определенного рН имеет значение для предотвращения гибели микроорганизмов от ими же образованных продуктов обмена. С этой целью питательную среду забуферивают, чаще всего используя фосфатный буфер. При сильном выделении бактериями кислот как продуктов обмена, к питательной среде добавляют карбонат каль- ция–СаO2.

5. Среда должна обладать определенным осмотическим давлением. Большинство бактерий способны расти на изотоничных средах, изотоничность которых достигается добавлением NaCl в концентрации 0,87 %. Некоторые бактерии не способны расти на средах при концентрации соли в них ниже 1 %. Такие бактерии называются галофильными.

Так как устойчивость к осмотическому давлению определяется наличием у бактерий клеточной стенки, то бактерии, лишенные клеточной стенки, микоплазмы и L-формы могут расти на питательных средах, содержащих гипертонический раствор, обычно раствор сахарозы.

При необходимости к питательной среде добавляют факторы роста, ингибиторы роста определенных бактерий, субстраты для действия ферментов, индикаторы.

6. Питательные среды должны быть стерильными во избежание искажения результатов исследования.

В зависимости от консистенции питательные среды могут быть:

1–жидкими, 2–полужидкими, 3–плотными. Плотность среды достигается добавлением агара.

Агар – полисахарид, получаемый из водорослей. Он плавится при температуре 100 оС, но при охлаждении остывает при температуре 45–50° С. Агар добавляют в концентрации 0,5 % для полужидких сред и 1,5–2 % – длясоздания плотных сред.

Преимуществом плотных питательных сред является воз-

можность получения чистых культур микроорганизмов, а также сообществ микроорганизмов (колоний, бактериальных газонов), имеющих макроскопические размеры.

Вбактериологической практике используют среды, различные по происхождению.

Синтетическими питательными средами называют такие, которые состоят из растворов химически чистых соединений в точно установленных дозировках. Преимуществом синтетических сред являются их строго постоянный состав и воспроизводимость.

Полусинтетические среды включают наряду с химически чистыми соединениями переработанные нативные компоненты неопределенного состава – гидролизаты мяса, дрожжевой экстракт и т.д.

Натуральные питательные среды представляют собой неизмененные нативные (природные) компоненты (сыворотка крови, яичный белок и др.).

30