obschaya_mikrobiologia_metodicheskie_ukazania

Приготовление питательных сред. Основой большинства питатель-

ных сред является мясная вода. Ее готовят из свежей нежирной говядины или конины. Для этого мясо освобождают от фасций, связок, сухожилий, удаляют жир, нарезают мелкими кусочками или пропускают через мясорубку. Взвешивают и заливают двойным количеством воды и оставляют на 18–24 ч в прохладном месте. Затем фарш отжимают, а мясной экстракт кипятят на слабом огне в течение 40–60 мин. Фильтруют и доливают водой до первоначального объема. Разливают по колбам и стерилизуют в течение 30 мин при температуре 120о С.

Мясопептонный бульон (МПБ) готовят на мясной воде. К 1 л мясной воды добавляют 1 % пептона, 0,5 % натрия хлорида. Кипятят до растворения пептона, все время при этом помешивая. Устанавливают требуемый показатель рН. Реакцию среды доводят до 7,2–7,6, подщелачивая 10 % раствором КОН или NаОН. После добавления щелочи бульон кипятят в течение 5– 10 мин и фильтруют через увлажненный дистиллированной водой бумажный фильтр. Затем среду разливают по пробиркам и стерилизуют в течение 20 мин при температуре 120о С.

Мясопептонный агар (МПА). Для приготовления мясопептонного агара (МПА) к мясопептонному бульону добавляют 2,5–3% мелко нарезанного агар-агара. Агар-агар плавят в бульоне, доводя до кипения, устанавливают рН, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по пробиркам в горячем виде и автоклавируют при 1 атм 30 мин.

В настоящее время среды готовят из сухих питательных смесей, содержащих остатки продуктов рыбного, костно-мясного происхождения, гидролизаты кормовых дрожжей в соответствии с инструкцией.

По целевому назначению питательные среды делят на основные, элективные и дифференциально-диагностические.

К основным относятся среды, применяемые для выращивания многих бактерий. Это пептические гидролизаты мясных, рыбных продуктов, крови животных или казеина, из которых готовят жидкую среду – питательный бульон и плотную – питательный агар. Такие среды также служат основой для приготовления сложных питательных сред – сахарных, кровяных и др., удовлетворяющих пищевые потребности патогенных бактерий.

Элективные питательные среды предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида (или определенной группы) из материалов, содержащих разнообразную постороннюю микрофлору. При создании элективных питательных сред исходят из биологических особенностей, которые отличают данные микробы от большинства других. Например, избирательный рост стафилококков наблюдается при повышенной концентрации хлорида натрия, холерного вибриона – в щелочной среде и т.д.

Дифференциально-диагностические питательные среды применяют для различения (дифференциации) отдельных видов (или групп) микробов. Принцип составления этих сред основан на различиях в биохимической активности бактерий разных видов вследствие неодинакового набора ферментов.

31

В состав дифференциально-диагностической среды входят сле-

дующие компоненты: а) основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий, б) определенный углевод (например, лактоза), способность использовать который является диагностическим признаком для данного вида, в) цветной индикатор (например, индикатор Андреде), изменение цвета которого свидетельствует о сдвиге рН среды в кислую сторону вследствие ферментации соответствующего углевода. Дифференци- ально-диагностические среды широко используют в лабораторных микробиологических диагностических исследованиях для дифференциации и идентификации бактерий.

ЗАНЯТИЕ 6

Тема: ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ. ФЕРМЕНТЫ БАКТЕРИЙ. АНТИМИКРОБНОЕ ДЕЙСТВИЕ ФИЗИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ. МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ

Цель занятия: изучить сахаролитические и протеолитические свойства микробов; познакомиться с методами стерилизации, охарактеризовать ее условия, аппаратуру, режим, используемый материал; изучить результаты первого дня выделения чистой культуры аэробов и продолжить ее выделение (2-й день).

План занятий

1.Основные группы ферментов бактерий. Значение ферментов для жизнедеятельности бактерий и идентификации видов.

2.Идентификация бактериальной культуры: а) по культуральным признакам; б) по биохимическим свойствам.

3.Методы определения ферментов микроорганизмов.

4.Стерилизация. Методы стерилизации.

5.Определение эффективности стерилизации.

6.Выделение чистой культуры микроорганизмов (продолжение).

Задания для выполнения лабораторной работы

1. Учесть результаты первого дня выделения чистой культуры микроорганизмов и продолжить ее выделение (2-й день): а) описать морфологию колоний на чашках с МПА (табл. 7); б) отобрать изолированные колонии; в) из половины колонии сделать мазки, окрасить по Граму; г) пересеять исследуемую колонию на скошенный агар.

Методика изучения культуральных свойств микробов. Культураль-

ные признаки микроорганизмов определяются характером роста их на плотных, жидких и полужидких питательных средах. Культуральные свойства

32

характерны для каждого вида микроба и поэтому являются важным видовым признаком.

Рост микробов на плотной питательной среде. Чашки с посевами просматривают сначала невооруженным глазом или через лупу, затем помещают их на столик микроскопа вверх дном и исследуют колонии в проходящем свете с объективом малого увеличения и суженой диафрагмой.

Колонии характеризуют по следующим признакам: размер, форма, прозрачность, контур края, рельеф, поверхность, цвет, структура и консистенция.

Размеры колоний определяются ее диаметром. В зависимости от диаметра различают колонии: точечные (диаметр меньше 1 мм), мелкие (диаметр 1–2 мм), средние (диаметр 2–4 мм), крупные (диаметр 4–6 мм и более).

Форма колоний круглая, овальная, ветвистая, амебовидная и др. Характер контура края колоний: ровный, изрезанный, лопастный, ло-

конообразный, бахромчатый и т.д.

Рельеф колоний характеризуется приподнятостью ее над поверхностью среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Рельеф колонии определяется невооруженным глазом или с лупой при рассмотрении ее сверху и сбоку. Различают колонии каплеобразные, куполообразные, конусообразные, с вдавленным центром.

Поверхность колоний: ровная или складчатая, матовая или блестящая, сухая или влажная и т.д.

Прозрачность колоний: прозрачные или непрозрачные в разной степе-

ни.

Консистенция колоний: пастообразная, вязкая, слизистая, волокнистая, плотная, хрупкая, сухая и т.д. Консистенцию колонии определяют посредством прикосновения или взятия из нее части материала бактериологической петлей.

Цвет колоний определяется пигментом, который продуцирует культура микробов. Красный цвет образуют некоторые актиномицеты, дрожжи, бактерии. Синий цвет характерен для синегнойной палочки, желтый и золотистожелтый образуют стафилококки, сарцины. Черные и бурые пигменты вырабатывают некоторые грибы, азотобактер и другие микроорганизмы. Большинство патогенных бактерий пигмента не образуют, вследствие чего колонии их бесцветны или молочно-мутного цвета.

33

Примечание: характеристики 5–7 изучаются при малом увеличении микроскопа.

Особенности микробного роста на жидких питательных средах.

Поверхностный рост: пристеночное кольцо, нежная пленка, грубая морщинистая пленка, поверхностный рост отсутствует. Помутнение среды: слабое, умеренное, сильное, стойкое, отсутствует. Осадок: плотный, зернистый, вязкий, в виде клочка ваты, в виде хлопьев, крошковатый и т.д. Количество осадка: обильное, скудное, отсутствует. Цвет среды: не изменен, изменен (приобретает окраску пигмента, образуемого микроорганизмом). Газообразование: наличие или отсутствие пузырьков газа.

Рост микробов на полужидкой питательной среде. Форма колоний:

круглые, овальные, разветвленные. Размеры колоний: точечные, средние, крупные. Края: ровные, разорванные, лопастные, зубчатые. Поверхность: матовая, блестящая, ровная или складчатая. Разжижение среды: быстрое, медленное, отсутствует.

Особенности роста микроорганизмов по уколу. В верхней части рас-

тут аэробы, в нижней – анаэробы. Стержень: длинный, короткий, в виде плоской ленты и т.д. Боковые отростки: длинные, короткие, в виде ершика, елочки, елочки вершиной вниз и т.д. Разжижение среды: не разжижает, разжижает полностью, послойно, воронкой, кратером и т.д. Газообразование: наличие или отсутствие пузырьков газа.

2. Изучить сахаролитические и протеолитические ферменты микробов кишечной группы при посеве на «пестрый» ряд и мясопептонный бульон.

При биохимической дифференциации микробов определяют их свойства: 1–сахаролитические – способность сбраживать углеводы с образовани-

ем кислоты и газа или только кислоты; 2 –протеолитические – способность разлагать белковые продукты с об-

разованием сероводорода, индола и других веществ; 3–редуцирующие – способность восстанавливать некоторые химиче-

ские вещества (краски и др.).

Сахаролитические свойства микробов определяют путем посева чистой культуры на специальные дифференциально-диагностические питательные среды, содержащие различные углеводы (лактозу, сахарозу, глюкозу, мальтозу, маннит и др.) и индикатор (нейтральный красный, лакмус, фуксин основной и др.). Наиболее распространенной является среда Гисса, которая представляет собой смесь сахара и индикатора в пептонной воде. Для улавливания газа на дно пробирки со средой опускают «газовки» – поплавки для улавливания газа. Образовавшийся в процессе ферментации газ вытесняет часть среды и скапливается вверху «газовки». При этом разложение мик-

34

роорганизмами того или иного углевода сопровождается цветной реакцией благодаря присутствию индикатора. Короткий "пестрый ряд" включает жидкие среды Гисса с моно- и дисахаридами: глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и с 6-атомным спиртом – маннитом. В длинный "пестрый ряд" наряду с перечисленными углеводами вводят среды с разнообразными моносахаридами (арабиноза, ксилоза, рамноза, галактоза и др.) и спиртами (глицерин, дульцит, инозит и др.). В зависимости от вида микроорганизмов сбраживание углеводов происходит с образованием различных продуктов, в основе которых лежат различные виды брожений (спиртовое, уксуснокислое, молочнокислое и др.).

Методика определения сахаролитических свойств. Культуру микро-

организмов высевают на жидкие среды Гисса (5 пробирок с глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и маннитом). Помещают в термостат при температуре 37о С. Определяют по демонстрационным препаратам в каждой пробирке происшедшие изменения, указывают наличие кислотообразования буквой «К», что видно по покраснению среды, и газообразования буквой «Г», в том случае, если поплавок заполнен газом. Приготавливают препарат-мазок, окрашивают по Граму. Микроскопируют и определяют морфологию микроба. Зарисовывают микроскопическую картину.

Определение протеолитических свойств микробов проводят на сре-

дах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном.

Пептон – промежуточный продукт распада белков, представляет собой смесь полипептидов и аминокислот. Хорошо растворяется в воде и не свертывается при нагревании. Получают пептон из рубцов крупного и мелкого рогатого скота. Желатин – животный клей, состоящий из белка сухожилий, костей, хрящей. Светло-коричневого цвета, без запаха и вкуса. Плавится при температуре 32–34 оС, застывает при температуре 16 оС. При посеве уколом в столбик желатиновой среды микробы, разлагающие желатин, разжижают среду. Действие микроорганизмов, разлагающих казеин, проявляется в пептонизации молока, которое приобретает вид молочной сыворотки.

В процессе ферментации пептонов микроорганизмы образуют индол (С8Н7N), сероводород (Н2S), аммиак (NH3) и другие соединения. При наличии сероводорода фильтровальная бумага, пропитанная раствором уксуснокислого свинца, чернеет. Для выявления индола используют индикаторную бумагу, пропитанную раствором щавелевой кислоты (метод Морелли). В присутствии индола бумага краснеет. Аммиак определяют при помощи увлажненной красной лакмусовой бумаги. В присутствии аммиака бумага синеет.

Методика определения сероводорода. Над культурой исследуемых микробов помещают полоску фильтровальной бумаги, смоченную раствором уксуснокислого свинца или сульфатом железа (бумага закрепляется между пробкой и стенкой пробирки). Пробирки помещают до трех суток в термостат. Почернение бумаги происходит при выделении сероводорода, который превращает уксуснокислый свинец в сернокислый или в нерастворимый сульфид железа. Продукцию сероводорода можно определить также путем посева исследуемой культуры микробов уколом в столбик с питательной средой, содержащей различные соли (сульфат железа, тиосульфат натрия,

35

сульфит натрия). При образовании Н2S среда окрашивается в черный цвет за счет образования сульфида железа (FeS).

Методика определения индола. Определение индола по методу Морелли осуществляют с помощью полоски фильтровальной бумаги, обработанной горячим насыщенным 12 % водным раствором щавелевой кислоты и высушенной в термостате. Бумагу закрепляют между пробкой и стенкой пробирки. Пробирки с исследуемой культурой помещают в термостат на трое суток. Порозовение нижней части индикаторной бумаги указывает на наличие индола. Также индол можно определить по методу Эрлиха. Для этого в пробирку с исследуемой культурой микробов добавляют 2–3 мл эрифа, энергично перемешивают и прибавляют несколько капель реактива Эрлиха (спиртовой раствор параметиламидобензальдегида с хлористоводородной кислотой). При наличии индола наблюдается розовое окрашивание или розовое кольцо.

В бактериологической практике иногда ограничиваются изучением сахаролитических и протеолитических свойств исследуемых бактерий, если этого достаточно для их идентификации.

Редуцирующие свойства микробов. Редукцией или восстановлением того или иного вещества называется химический процесс, состоящий в отнятии кислорода от данного вещества или замене его водородом. Имеются вещества, которые при редукции легко обесцвечиваются. Важным признаком у микробов является способность к образованию фермента каталазы. Для ее обнаружения на предметное стекло наносят каплю 1–3% раствора перекиси водорода и в нее вносят бактериологической петлей исследуемую культуру микробов. При положительном результате наблюдают выделение пузырьков газа в результате разложения Н2О2 на кислород и воду.

При необходимости исследуют другие признаки, например способность восстанавливать нитраты, карбоксилировать аминокилоты, образовывать оксидазу, плазмокоагулазу, фибринолизин и другие ферменты.

3. Результаты идентификации выделенной культуры записать в табл. 8.

Таблица 8

Характеристика культуры по морфологическим и физиологическим признакам (форма протокола)

Примечание: Ферментация углеводов может происходить до кислоты (К+) или кислоты и газа (К+Г+).

36

4. Записать классификацию ферментов микроорганизмов. Классификация ферментов: а) по характеру вызываемых превращений:

гидролазы, оксидоредуктазы, трансферазы, лиазы, изомеразы, лигазы; б) по месту локализации: эндо- и экзоферменты; в) конститутивные, индуцибельные ферменты; г) по расщепляемому субстрату: сахаролитические, протеолитические, липолитические.

Микробиологические ферменты широко используются в медицине и промышленности. Так, получаемые из Aspergillus niger кислотоустойчивая амилаза и протеаза применяются как лекарственные средства, способствующие пищеварению. Для заживления ран и ожогов могут применяться стреп-

токиназа (из Streptococcus spheroides) и коллагеназа (из Clostridium hystolyticum).

5. Записать методы стерилизации, охарактеризовать ее условия, полноту, аппаратуру, режим, используемый материал в табл. 9.

Вопросы для обсуждения

1. Идентификация микроорганизмов по культуральным свойствам. 2. Классификация ферментов бактерий по месту действия, по времени образования, биохимическим свойствам, по расщеплению различных веществ. 3. Роль ферментов для жизнедеятельности бактерий. 4. Идентификация микроорганизмов по биохимическим свойствам. 5. Определение сахаролитической активности микробов. 6. Определение протеолитической активности микробов. 7. Принципы стерилизации. 8. Аппаратура, используемая для стерилизации. 9. Методы стерилизации микробиологического инструментария. 10. Методы стерилизации питательных сред. 11. Определение эффективности стерилизации.

Оформление лабораторных тетрадей

Описать морфологию колоний на МПА согласно табл. 7; записать характеристику культуры микробов по морфологическим и физиологическим признакам согласно табл. 8; заполнить табл. 9; записать ход исследования по выделению чистой культуры микробов.

37

Дополнительный материал

Стерилизация. Методы стерилизации инструментов и медицин-

ских изделий. Основные нормативные документы, регламентирующие требования к соблюдению дезинфекционного режима в лечебнопрофилактических учреждениях: Федеральный закон «О санитарноэпидемиологическом благополучии населения» № 52–ФЗ от 30.03.1999 г.; «Стерилизация и дезинфекция изделий медицинского назначения. Методы, средства и режимы»; «Методические указания по дезинфекции, предстерилизационной очистке и стерилизации изделий медицинского назначения» от 30 декабря 1998 г. № 287–113; «Методические указания по контролю работы паровых и воздушных стерилизаторов» от 28.02.1991 г. № 15/6-5.

Стерилизация – метод, обеспечивающий гибель в стерилизуемом материале вегетативных и споровых форм патогенных и непатогенных микроорганизмов.

Этапы стерилизации: 1–дезинфекция; 2–предстерилизационная очистка (ПСО); 3–стерилизация.

Качество предстерилизационной очистки изделий оценивается путем постановки азопирамовой или амидопириновой проб на наличие остаточных количеств крови, а также путем постановки фенолфталеиновой пробы на наличие остаточных количеств щелочных компонентов моющих средств.

Методы стерилизации:

1 – термические (паровой, воздушный, глассперленовый); 2 – химические (газовый, растворы химических соединений); 3 – радиационный; 4 – плазменный и озоновый (группа химических средств).

В условиях клиник России наиболее распространенными методами стерилизации инструментов и медицинских изделий являются: паровой (автоклавирование), воздушный (сухожаровой шкаф), химический (газовый, растворами химических соединений).

Термические методы

1. Самым распространенным в мире способом стерилизации является

паровая стерилизация, или автоклавирование. Дан-

ный метод высокоэффективен, экономичен и приемлем для большинства медицинских изделий. По данным статистики, 75 % общего объема госпитальной стерилизации в мире приходится на паровой метод. Стерилизующим агентом при использовании этого метода является водяной пар под избыточным давлением. Однако эффективная стерилизация может быть достигнута только при одновременном сочетании всех факторов стерилизации: необходимой температуры, достаточного давления и воздействия на поверхности пара в течение нужного времени. Оптимальным для стерилизации является насыщенный пар (число молекул жидкости, пе-

38

решедших в газообразное состояние, равно числу молекул, возвращающихся в жидкое состояние, то есть всегда постоянно). Влажный пар содержит в своем составе капельки жидкости (конденсат), которые резко ухудшают качество стерилизации и увеличивают риск реинфицирования простерилизованных изделий. В сухом паре количество молекул газообразного состояния недостаточно для данного объема, что тоже отрицательно влияет на качество стерилизации. Перегретым называется такой пар, температура которого выше, чем температура насыщенного пара при том же давлении. Бактерицидные свойства перегретого пара приближаются к свойствам нагретого воздуха.

Малыми считаются стерилизаторы с камерой меньше 70 л. Компактный стерилизатор с камерой в пределах 25 л, со своим парогенератором, вакуумным насосом, печатающим устройством, управляемый микрокомпьютером – основа современной стерилизации.

Все стерилизаторы с объемом камеры больше 70–75 л, как правило, устанавливаются стационарно. В крупных лечебных учреждениях все такие аппараты объединяются в одном помещении, дополняются вспомогательной техникой (мойки, сушилки, и пр.) и называются ЦСО (центральное стерилизационное отделение). Как правило, объем камеры у стационарных стерилизаторов находится в пределах от 70 до 600 л.

2. В России все еще широко используется воздушная, или сухожаровая, стерилизация. Для воздушной стерилизации применяются следующие программы: а) рабочая температура в стерилизационной камере 180 оС, время стерилизационной выдержки – 60 мин; б) рабочая температура в стерилизационной камере 160 оС, время стерилизационной выдержки – 150 мин.

В развитых странах высокая энергопотребляемость, отсутствие надежных методов упаковки и высокая температура воздействия свели применение данного метода к единичным случаям. Даже в самом современном стерилизаторе при неумелой загрузке стерильность не будет достигнута. Неправильная загрузка может привести к образованию замкнутых полостей и воздушных прослоек, где температура окажется ниже, чем показания термометра. В результате часть изделий окажется не-

стерильной.

Одним из вариантов воздушных стерилизаторов являются вакуумные шкафы, имеющие герметичную камеру. Вакуум в них создается внешним компрессо-

ром, а температурный диапазон такой же, как и в обычных стерилизаторах. Такие аппараты идеальны для высушивания образцов до постоянной массы.

Оба метода используют рабочую температуру рабочего цикла от 121 до 180 °С, что вызывает термическое повреждение термочувствительных материалов (пластики, оптика, электронные блоки). Поэтому в связи с развитием современных медицинских технологий и широким внедрением в практику здравоохранения высокоточных инструментов и сложного дорогостоящего оборудования возникла необходимость в щадящих низкотемпературных методах стерилизации (в мировой практике встречаются 3 основных метода

39

низкотемпературной стерилизации: газовый этиленоксидный, газовый формальдегидный и плазменный).

3. Гласперленовый метод предназначен для быстрой стерилизации небольших цельнометаллических инструментов, не имеющих полостей, каналов и замковых частей. Метод крайне прост: инструмент погружается в среду мелких стеклянных шариков, нагретых до температуры 190–290 оС (таким образом, чтобы над рабочей поверхностью инструмента оставался слой шариков не менее 10 мм) на 20–180 с, в зависимости от размера и массы инструмента. Этот метод используется, в основном, стоматологами для экс- пресс-стерилизации мелких инструментов – боров, пульпоэкстракторов, корневых игл, алмазных головок и др., а также рабочих частей более крупных -

зондов, гладилок, экскаваторов, шпателей и т.д. Так же можно стерилизовать акупунктурные иглы.

Преимущества метода – короткое время стерилизации и отсутствие расходных материалов

Химическая стерилизация

Для термолабильных медицинских изделий (эндоскопы и принадлежности к ним, диализаторы, катетеры и т.п.) наиболее приемлемым является метод газовой стерилизации. Для этого используются химические соединения, обладающие безусловным спороцидным действием: окись этилена, бромистый метил, смесь окиси этилена и бромистого метила (смесь ОБ) и формальдегид. Несмотря на то, что окись этилена является токсическим веществом (при однократном воздействии проявляет себя как малоопасное вещество 4-го класса опасности, при постоянном воздействии – как вещество 2-го класса опасности), она чрезвычайно популярна в качестве стерилизующего агента.

Газовая стерилизация – метод значительно более сложный, чем традиционные методы стерилизации паром и горячим воздухом. При этом необходимо на строго определенном уровне поддерживать температуру, влажность, концентрацию стерилизующего газа, давление и экспозицию. Это возможно только при наличии оборудования с автоматическим прохождением цикла.

1. Газовая стерилизация при помощи оксида этилена.

Наиболее широко в мире применяется стерилизация с помощью этиленоксида. Этиленоксидная стерилизация прекрасно зарекомендовала себя в большинстве стран мира, оборудование для ее проведения выпускается большим количеством производителей в различных странах Европы и Америки. Стерилизация проводится при температуре 42–55 оС за 60–90 мин. Результат практического использования показывает значительное превосходство этиленоксидного метода стерилизации над альтернативными в универсальности, экономичности, ремонтопригодности и технической обеспеченности. Применение данного метода для стерилизации высокоточной термола-

40