obschaya_mikrobiologia_metodicheskie_ukazania

ЗАНЯТИЕ 2

Тема: СТРУКТУРА БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ И МЕТОДЫ ЕЕ ИЗУЧЕНИЯ

Цель занятия: изучить структурные особенности прокариотических микроорганизмов, овладеть сложными методами окраски для выявления структурных компонентов бактериальной клетки.

План занятий

1.Классификация микроорганизмов.

2.Ультраструктура бактериальной клетки.

3.Постоянные структурные элементы (клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана, нуклеоид, цитоплазма, мезосомы, рибосомы), строение, функции, методы выявления.

4.Непостоянные структурные элементы бактериальной клетки (капсула, споры, жгутики, включения, ворсинки, плазмиды). Строение, функции, методы выявления.

5.Особенности строения клеточной стенки бактерий. Грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы. Окраска по Граму, механизм, значение для классификации бактерий.

6.Отличительные признаки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Протопласты и сферопласты.

7.Исследование микробов в живом состоянии. Характеристика методов «висячей» и «раздавленной» капли.

8.Сложные методы окраски микроорганизмов.

Задания для выполнения лабораторной работы

1. Приготовить мазки из смеси культур грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, окрасить по Граму, изучить под микроскопом.

Сложные методы окраски предусматривают последовательное использование нескольких красителей различного химического состава, что позволяет выявить определенные структуры бактериальной клетки.

Окраска по методу Грама. Все бактерии по отношению к окраске по методу Грама делятся на грамположительные – темно-фиолетового цвета и грамотрицательные – красного. Способность микроорганизмов окрашиваться в тот или иной цвет зависит от строения клеточной стенки бактерий, ее химического состава.

Техника окраски по методу Грама:

-окрасить мазок генциан-виолетом (2 мин, через фильтровальную бумагу);

-бумагу удалить, оставшуюся краску слить;

-окрасить мазок раствором Люголя (1 мин);

11

-раствор Люголя слить и нанести несколько капель чистого 96% спирта (на 30-40 с осторожно покачивая стеклом);

-тщательно смыть спирт водой;

-окрасить водным фуксином – (2 мин);

-промыть водой и высушить при помощи фильтровальной бумаги.

Мазок поместить на предметный столик микроскопа, нанести в центр каплю иммерсионного масла, промикроскопировать. Зарисовать грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы.

Некоторые виды бактерий образуют внутриклеточные (эндогенные) споры. В отличие от вегетативной клетки они обладают меньшим количеством свободной воды, а так же высоким содержанием липидов и кальция.

Зрелая спора с трудом поддается окрашиванию из-за малой проницаемости оболочки. Проницаемость оболочки резко увеличивается после обработки горячей соляной кислотой или при использовании концентрированного раствора краски с подогревом.

Техника окраски спор по методу Ожешко:

-нанести несколько капель 0,5% раствора соляной кислоты на нефиксированный мазок и нагреть до появления паров (2-3 мин);

-слить кислоту, промыть водой, высушить;

-зафиксировать в пламени;

-окрасить по методу Циля-Нильсена (при этом споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы – в синий).

Техника окраски по методу Циля-Нильсена:

-нанести несколько капель карболового фуксина на фиксированный мазок, покрытый фильтровальной бумагой и подогреть до появления паров

(3–5 мин);

-бумагу снять, мазок охладить и обесцветить 5% раствором серной кислоты

и3% раствором солянокислого спирта (2–4 с);

-тщательно промыть водой;

-окрасить синькой Леффлера (3–5 мин);

-промыть водой и высушить споры.

Кислотоустойчивые бактерии в результате такой окраски становятся рубиново-красными, а все остальные – синими.

2. Приготовить мазок по методу Бурри-Гинса, промикроскопировать, зарисовать.

Многие виды микроорганизмов обладают способностью откладывать на поверхности своего тела мощный слизистый слой вокруг клеточной стенки, его называют капсулой. Капсулы имеют консистенцию геля, поэтому при микроскопии живых бактерий они видны очень плохо. Для их обнаружения применяют негативную окраску. При негативных способах краситель заполняет пространство вокруг бактерий, в результате чего они выглядят светлыми частицами на темном фоне.

Техника обнаружения капсул по методу Бурри–Гинса:

-приготовить тушевой препарат по Бурри (смешать каплю взвеси микробов с каплей туши и при помощи стекла со шлифованным краем приготовить ма-

12

зок, как мазок из крови), затем высушить и зафиксировать (налить на поверхность мазка 96% этиловый спирт и поджечь);

-окрасить препарат водным фуксином (1–2 мин);

-промыть препарат водой, высушить на воздухе и микроскопировать.

Бактерии окрашиваются в красный цвет, неокрашенные капсулы выявляются на черно-розовом фоне.

3. Внести основные методы окраски бактериальной клетки (по Граму, Ожешко, Цилю–Нильсену, Бурри–Гинсу, Нейссеру, Романовскому–Гимзе, Здродовскому) в таблицу 1.

4. Изучить нативные неокрашенные препараты, используя методы «раздавленной» или «висячей» капли.

Прижизненная (витальная) окраска

Взвесь микроорганизмов вносят в каплю 0,001% раствора метиленового синего или нейтрального красного. Затем готовят препарат «раздавленная» или «висячая» капля и микроскопируют его.

Приготовление препарата “висячая капля”. Его готовят на предмет-

ном стекле с луночкой (углублением):

-края луночки смазывают тонким слоем вазелина;

-культуру микроорганизмов наносят на середину необезжиренного покровного стекла. Если микроорганизмы выращены в жидкой среде, то берут каплю такой культуры, если на плотной, то вначале на покровное стекло наносят каплю стерильного физиологического раствора, а затем бактериологической петлей культуру микробов;

-предметное стекло переворачивают на 180о и аккуратно накладывают на покровное так, чтобы капля оказалась в центре луночки;

-готовый препарат переворачивают в прежнее положение.

Втаком препарате капля подвешена с внутренней поверхности покровного стекла и находится в герметически закрытой влажной камере, что позволяет наблюдать за движением микробов длительное время. Препарат рассматривают под микроскопом с плоским зеркалом и суженной диафрагмой. При малом увеличении (х8) находят край капли, отчетливо видный в затемненном поле зрения. Устанавливают его в центре поля зрения микроскопа. Не сдвигая препарат, переходят на иммерсионную систему, слегка расширив диафрагму.

Приготовление препарата “раздавленная капля”. Его готовят на предметном стекле: на поверхность предметного стекла наносят каплю 16–24-часовой микробной культуры и раздавливают ее, накладывая покровное стекло. При раздавливании капли нужно избегать образования в ней пу-

13

зырьков воздуха. Для этого покровное стекло ставят на ребро у края капли, опускают, постепенно вытесняя воздух. Если часть жидкости выступает, ее удаляют фильтровальной бумагой.

Препарат “раздавленная капля”, предназначенный для выявления подвижности микроорганизмов, рассматривают под микроскопом с большим увеличением (объектив 40, окуляр 10 или 15, при опущенном конденсоре).

Вопросы для обсуждения

1. Классификация микроорганизмов по Берги. 2. Постоянные и непостоянные структурные элементы микробной клетки. 3. Внутренние и поверхностные структурные элементы микробной клетки. 4. Строение и функции постоянных структурных элементов (нуклеоид, цитоплазма, цитоплазматическая мембрана, клеточная стенка, мезосомы, рибосомы). 5. Дифференциация бактерий с помощью окраски по методу Грама. 6. Особенности строения клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. 7. Техника окраски микробов по методу Грама. 8. Отличительные признаки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. 9. Строение и функции непостоянных структурных элементов бактериальной клетки (капсула, споры, жгутики, включения, ворсинки, плазмиды). 10. Методы выявления непостоянных структурных элементов микробов: Шеффера–Фултона, Ожешко, Циля–Нильсена, Бурри–Гинса, Нейссера. 11. Характеристика методов исследования микроорганизмов в живом состоянии. 12. Этапы приготовления «висячей» и «раздавленной» капли.

Оформление лабораторной тетради

Заполнить в тетради таблицы 1 и 2; зарисовать микропрепараты из исследуемого материала (окраска по методу Грама и Бурри–Гинсу); зарисовать демонстрационные препараты, а также схематическое строение клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Дополнительный материал

Различия в окраске по Граму связаны с некоторыми особенностями строения клеточной стенки бактерий. В однослойной клеточной стенке грамположительных микробов имеется несколько рядов пептидогликана (до 80 % от массы клеточной стенки), поры которого при обработке этиловым спиртом сужаются и препятствуют выходу комплекса, образуемого при взаимодействии красителя генцианового фиолетового с компонентами клетки в присутствии йода, входящего в состав люголя. Также в поверхностном слое клетки находится магниевая соль рибонуклеиновой кислоты, которая в присутствии йода в кислой среде образует прочное соединение с основным красителем – генциановым фиолетовым. Поэтому грамположительные микробы прочно удерживают первый наносимый краситель – генциан-виолет и окрашиваются в фиолетовый цвет.

14

У грамотрицательных микроорганизмов имеется двуслойная клеточная стенка. Во внутренний слой входят всего один-два ряда пептидогликана. Верхний слой представлен наружной мембраной, включает фосфолипиды, белки и липополисахарид (ЛПС). Отсутствует магниевая соль рибонуклеиновой кислоты. В связи с этим не образуется прочного соединения компонентов клеточной стенки с основным красителем. Они легко обесцвечиваются этиловым спиртом. Поэтому клетки бактерий окрашиваются в цвет последнего наносимого на их поверхность красителя (водный фуксин) – в красный.

Таблица 2

Отличительные признаки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов

15

ЗАНЯТИЕ 3

Тема: ОСОБЕННОСТИ МОРФОЛОГИИ И СТРОЕНИЯ ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Цель занятия: изучить прокариотические микроорганизмы-актиномицеты, спирохеты, микоплазмы, риккетсии и хламидии; освоить сложные методы окраски для обнаружения спирохет и риккетсий.

План занятий

1.Понятие об эукариотах и прокариотах, их отличительные признаки, представители.

2.Характеристика актиномицетов как переходной группы микроорганизмов от истинных бактерий к грибам.

3.Морфология и ультраструктура спирохет. Классификация спирохет.

4.Особенности морфологии и структуры микоплазм. Полиморфизм микоплазм. Патогенные виды. Стабильные и нестабильные L-формы бактерий.

5.Положение в систематике микроорганизмов риккетсий и хламидий. Их морфология, строение и химический состав.

Задания для выполнения лабораторной работы

1.Изучить под микроскопом и зарисовать демонстрационные препараты прокариотических микроорганизмов: актиномицетов, спирохет, риккетсий.

2.Приготовить мазок из зубного налета, окрасить по методу Романов- ского–Гимзы, изучить под микроскопом и зарисовать обнаруженные формы микроорганизмов.

Окраска по методу Романовского–Гимзы относится к сложным уни-

версальным методам окраски микроорганизмов, позволяет выявить ядерные элементы и включения у простейших.

При окрашивании простейших их цитоплазма приобретает голубой цвет, а ядра – красно-фиолетовый. Этот метод используют также для обнаружения риккетсий, хламидий, спирохет, и определения форменных элементов крови.

Техника выполнения окраски по Романовскому–Гимзе.

-на мазок нанести рабочий раствор красителя (смесь метиленового синего, эозина и азура – 2 капли на 1 мл дистиллированной воды) на 10-20 мин;

-промыть водой и высушить.

Боррелии – возбудители возвратного тифа (B. recurrentis) окрашиваются в фиолетовый, эритроциты крови и цитоплазма лейкоцитов – в розовокрасный, ядра лейкоцитов – в фиолетовый цвет. Трепонемы окрашиваются в бледно-розовый цвет, лептоспиры – в розово-сиреневатый цвет.

16

Окраска по Бурри (Burri): на тщательно обезжиренном предметном стекле каплю исследуемой культуры микробов смешивают с каплей китайской туши, затем краем другого стекла тонким, ровным слоем распределяют по поверхности предметного стекла, как это делается при исследовании крови, высушивают на воздухе и исследуют с иммерсионной системой под микроскопом. На равномерно серо-черном фоне бледная спирохета имеет вид серебристо-белой спирали.

3. Приготовить мазок актиномицетов, окрасить по Граму, промикроскопировать и зарисовать.

Вопросы для обсуждения

1. Понятие об эукариотах и прокариотах, представители. 2. Отличительные признаки эукариотических и прокариотических клеток. 3. Структур- но-морфологические особенности актиномицетов. 4. Актиномицеты как переходная группа от истинных бактерий к грибам. 5. Морфология и структура спирохет. 6. Классификация спирохет. 7. Спирохеты как переходная группа от прокариот к простейшим. 8. Особенности морфологии и структуры микоплазм. 9. Полиморфизм микоплазм. 10. Стабильные и нестабильные L-формы бактерий. 11. Морфология и структура риккетсий и хламидий. 12. Отличительные признаки риккетсий и хламидий от вирусов и истинных бактерий. 13. Основные методы окраски актиномицетов, спирохет, риккетсий, хламидий и микоплазм. 14. Техника окраски микроорганизмов по методам Рома- новского–Гимзы и Здродовского.

Оформление лабораторной тетради

Зарисовать микропрепараты прокариотических микроорганизмов; записать методы окраски – по Романовскому–Гимзе и по Здродовскому; зарисовать демонстрационные препараты.

Дополнительный материал

17

Оболочка

18

Таблица 4

Морфологические особенности риккетсий, хламидий и микоплазм (по Тец В.В. и соавт., 2002)

ЗАНЯТИЕ 4

Тема: СИСТЕМАТИКА И КЛАССИФИКАЦИЯ ГРИБОВ И ПРОСТЕЙШИХ. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И БИОЛОГИЯ

ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Цель занятия: ознакомиться и изучить систематику и общие биологические свойства простейших и микроскопических грибов, освоить технику приготовления нативных препаратов микроскопических грибов.

План занятия

1.Систематика и общие биологические свойства простейших.

2.Морфологические особенности и структура жгутиковых простейших – возбудителей лямблиоза, трихомониаза и лейшманиоза.

3.Морфологические особенности и структура простейших класса Саркодовые (возбудители амебиаза).

4.Морфология и структура споровиков – возбудителей малярии и токсоплазмоза.

5.Морфология и структура ресничных простейших.

6.Методы изучения морфологии простейших.

19

7.Систематика грибов. Биологические свойства грибов: морфология, ультраструктура и химический состав.

8.Методы изучения морфологии грибов.

Задания для выполнения лабораторной работы

1. Приготовить препарат «раздавленная капля» из культуры плесневых грибов, изучить под микроскопом, определить на основании строения мицелия, плодоносящих гиф и спор родовую принадлежность, зарисовать.

Исследование микроорганизмов в живом состоянии

В живом состоянии микроорганизмы исследуют с целью выявления их формы, подвижности и других структур.

Морфологию грибов изучают в нативных и фиксированных препаратах. Для приготовления нативного препарата «раздавленная капля» с целью изучения морфологии плесневых грибов отделяют препаровальными иглами небольшой участок мицелия с плодоносящими гифами. Материал помещают в каплю воды на предметном стекле, иглой расправляют мицелий, придавливают покровным стеклом и микроскопируют (подробно изложено в занятии 2).

2.Изучить под микроскопом и зарисовать демонстрационные препараты простейших: трихомонад, лямблий, лейшманий, малярийного плазмодия.

3.Приготовить препарат из культуры дрожжеподобных грибов, окрасить метиленовым синим. Изучить под микроскопом и зарисовать.

Вопросы для обсуждения

1. Систематика простейших. 2. Общие биологические свойства простейших. 3. Общая характеристика жгутиковых простейших. 4. Морфология и структура лямблий. 5. Морфологические и структурные особенности трихомонад. 6. Морфологические особенности и структура простейших класса Саркодовые. 7. Морфология и структура дизентерийной амебы. 8. Общая характеристика споровиков. 9. Морфология и структура возбудителя малярии. 10. Морфологические и структурные особенности возбудителя токсоплазмоза. 11. Морфология и структура ресничных простейших. 12. Методы изучения морфологии простейших. 13. Биологические свойства грибов. 14. Методы изучения морфологии грибов.

Оформление лабораторных тетрадей

Заполнить таблицу 5; зарисовать демонстрационные препараты простейших, микропрепараты из культуры дрожжеподобных и плесневых грибов.

20