диссертации / 5

80

позволяющие визуализировать глюкокортикоидных гормонов в целых клетках.

На основании проведенных исследований установлено наличие как мембранных, так и цитозольных гормон-рецепторных комплексов.

Неожиданностью стало обнаружение несвязанных с лигандами рецепторов эстрогенов и прогестерона в ядрах клеток-мишеней. Полученные результаты привели к созданию трех независимых моделей внутриклеточной локализации рецепторов глюкокортикоидных гормонов и способствовали росту скептического отношения к данным, полученным на клеточных гомогенатах. В

последующих публикациях были установлены и проанализированы определенные ограничения и артефакты, характерные для методов радиоавтографии и иммунногистохимии. Вопрос о функциональной роли мембранных участков связывания глюкокортикоидных гормонов так и остался

нерешенным.

Предложенный в данной работе подход включает использование в качестве инструментов исследования локализации рецепторного аппарата глюкокортикоидных гормонов и молекулярного механизма их действия полимерных производных ряда природных и снтетических глюкокортикоидов

(ГК): гидрокортизона, преднизолона, дексаметазона. В качестве гидрофильного макромолекулярного носителя (м.м. порядка 25 000 Д) был выбран поли-(N-

винил-2-пирролидон), применяемый в медицинских целях и зарекомендовавший себя как биологически инертный препарат.

В контрольных экспериментах установлено, что в водных растворах

макромолекулы сополимеров структурированы и имеют более высокую компактность по сравнению с полимером носителя за счет гидрофобных взаимодействий стероидных фрагментов; обладают высокой гидролитической стабильностью в условиях, близких к физиологическим; не проникают в жизнеспособные клетки млекопитающих. Иммобилизация ГК по положению 21

на поливинилпирролидоне (НР-ГК) полностью сохраняет

комплексообразующую активность исходных стероидов с молекулярными

биологическими мишенями в модельных системах - сывороточным

81

альбумином, специфическим транспортным белком плазмы крови

транскортином и моноклональными антителами к ГК.

С использованием НР-ГК нами получены доказательства существования специфических мест связывания ГК на ПМ фибробластов кожи. Определены параметры связывания, относительная связывающая активность, исследованы механизмы трансмембранной передачи сигнала, их роль в формировании

конечного биологического ответа клеток.

В таблице 9 суммированы основные характеристики мембранных

рецепторов ГК: параметры специфического связывания Кд (равновесная константа диссоциации гормон-рецепторного комплекса), максимальная связывающая емкость, а также приведены данные об относительном сродстве рецепторов к различным стероидам.

Табл. 9. Характеристика рецепторных участков связывания ГК

Видно, что мембранные и внутриклеточные участки связывания различаются как аффинностью к гормонам, так и концентрацией мест связывания. Внутриклеточные рецепторы ГК характеризуются более высоким сродством (Кд порядка 10 нМ) и значительно меньшим числом связывающих участков (примерно в 20 раз). Отличаются эти две рецепторные системы и по способности связывать ГК гормоны и синтетические стероиды.

Для синтетических глюкокортикоидов дексаметазона и преднизолона

82

характерна избирательность связывания с внутриклеточными рецепторами ГК

(значения Кд мембранных и цитозольных рецепторов отличаются в среднем в

60 раз). Тропность природных глюкокортикоидов кортизола и кортикостерона к внутриклеточным рецепторам проявляется в меньшей степени (отношение соответствующих Кд составляет 4,2).

Следующим этапом наших исследований стало выяснение природы и механизмов развития мембранотропных эффектов ГК (схема 2).

Экпериментальная

модель

83

Схема работы:

Разработка экспериментальной модели изучения геномных и негеномных эффектов глюклокортикоидов – модели апоптоза и клеточной пролиферации - отбор оцениваемых параметров

Определение возможных кандидатов на молекулярные мишени для наноразмерного кортизол-полимерного комплекса

Оценка влияния наноразмерного кортизол-полимерного комплекса на внутриклеточные события, опосредованные его молекулярными мишенями

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что мембранные

эффекты ГК, пусковые механизмы которых локализуются на ПМ,

опосредуются системой вторичных внутриклеточных медиаторов.

Взаимодействие ГК с плазматическими мембранами клеток-мишеней изменяет

внутриклеточный уровень цАМФ, ионов кальция, инозитолфосфатов.

В зависимости от концентрации глюкокортикоиды выступают в качестве

модуляторов или ингибиторов цАМФ- и Саответа клеток:

в концентрации 0,1-1,0 мкМ, соответствующей диапазону

физиологических колебаний концентрации кортикостероидных гормонов в плазме крови человека, ГК не изменяют базальный уровень цАМФ и Ca2+ ,

потенцируют вызванное агонистами повышение содержания цАМФ,

опосредованно ингибируя Са-ответ клеток;

 в диапазоне концентраций 2,0-5,0 мкМ (средняя терапевтическая концентрация препаратов глюкокортикоидов в плазме) ГК не влияют на базальный уровень вторичных мессенджеров, уменьшают агонист-

индуцированный вход кальция через рецептор-управляемые Са-каналы;

 в концентрации выше 5 мкМ (экспериментальные фармакологические дозы глюкокортикоидов) ГК повышают базальный

84

уровень цАМФ, угнетая эффекторные звенья Са-ответа, активируемые продуктами гидролиза фосфатидилинозитол-трифосфата.

Ранее на различных экспериментальных моделях нами было показано,

что ГК повышают базальную концентрацию цАМФ, а также способны потенцировать действие других соединений, активирующих аденилатциклазу.

ГК по механизму конкурентной или синергистической активации усиливают повышение цАМФ, вызванное аденозином, изопротеронолом,

простагландином Е2. В то же время ГК не влияют на подъем цАМФ под действием фторида натрия, который по механизму стимуляции аденилатциклазы принципиально отличается от других активаторов. В отличие от перечисленных биологически активных веществ, влияние которых опосредовано взаимодействием с мембранными рецепторами, NaF способен непосредственно активировать регуляторные ГТФ-связывающие белки (G-

белки), передающие сигнал на каталитическую субъединицу аденилатциклазного комплекса. Полученные данные позволили авторам высказать предположение о том, что ГК непосредственно взаимодействуют с

G-белками ПМ. Эволюционно G-белки появились в животных клетках (в

бактериях нет промежуточного звена в виде ГТФ-связывающих белков), они служат дополнительным уровнем регуляции трансмембранной передачи сигнала. Обработка лимфоцитов периферической крови человека коклюшным токсином - селективным ингибитором Gi-белка приводила к значительному снижению цАМФ-ответа клеток на ГК, что подтверждает выдвинутое предположение. Однако, для окончательного решения вопроса о роли G-белков в механизме мембранотропного действия СГ требуются дополнительные исследования.

Существование рецепторов ГК, локализованных в цитоплазме клетки и на поверхности клеточной мембраны, обуславливает принципиальную возможность разделения регуляторных функций стероидов на разных уровнях клеточной организации. Так, внутриклеточные рецепторы ГК опосредуют геномные эффекты стероидов – влияние на синтез мРНК; способность

85

индуцировать запрограммированную клеточную гибель (апоптоз); стимуляция и ингибирование синтеза тканеспецифичных беклков, например, медиаторов воспаления и цитокинов, пуриновых и адренорецепторов. Негеномные,

мембраноопосредуемые эффекты включают влияние ГК на обмен вторичных мессенджеров, ионную проницаемость ПМ, трансмембранный транспорт глюкозы, нуклеозидов; высвобождение гистамина, продуктов метаболизма арахидоновой кислоты.

В задачи нашей работы входило определение вклада геномных и негеномных эффектов глюкокортикоидов в реализации их фармакологического действия (глюкокортикоид-индуцированный апоптоз фибробластов).

Последовательность биохимических и морфологических изменений отражена на схеме (схема 3); изучение фармако-биохимических маркеров начальных этапов апоптоза включало следующие этапы:

анализ изменения митохондриального ( м) и клеточного ( п)

мембранного потенциала на начальных этапах глюкокортикоид-

индуцированного апоптоза фибробластов с помощью амфифильного зонда-катиона ДСМ;

изучение влияния глюкокортикоидов на величину внутриклеточного рН с помощью флуоресцентного зонда BCECF;

сравнение закономерностей изменения внутриклеточного рН (рНвн) при апоптотической и некротической формах гибели фибробластов;

оценка динамики изменения концентрации внутриклеточного Са2+ ([Са2+]вн) при ГК-индуцированном апоптозе.

Схема 3. Последовательность событий при апоптозе.

На основе полученных результатов и литературных данных мы предлагаем следующую модель глюкокортикоид-индуцированного апоптоза. На начальных этапах (1-1,5 часа после индукции апоптоза) преобладают мембранотропные эффекты глюкокортикоидов (геномные и негеномные по механизму развития).

В фибробластах отмечается уменьшение трансмембранного потенциала,

усиление кальциевого обмена, характеризующееся ростом [Ca++]цит и

увеличением начальной скорости поглощения Са2+ [Halestrap, 1994; Скулачев, 1999]. Фактически, в начальный период еще не запущен механизм необратимого накопления ионов Са2+, которые, как полагают, при избыточном поступлении во внутриклеточные пулы (митохондрии, ядро и др.) сами могут оказывать прямое повреждающее действие на различные клеточные структуры,

в частности, ДНК [Mills et al., 2004; Snider et al., 2006]. Негеномные мембранотропные эффекты глюкокортикоидов, обусловленные непосредственным воздействием гормонов на плазматическую мембрану клеток, включают увеличение активности К+-каналов, ингибирование Na+/H+

обмена.

Сущность последующих стадиий апоптоза – манифестация геномных внутриклеточных эффектов глюкокортикоидов, которые определяются рецептор-опосредованной активацией определенных генов (Fas, c-myc, E1A, p53, bcl-2) и следующим за этим синтезом белков-продуктов онкогенов [Klein-

Hitpass et al., 1998]. В цитоплазме клеток активируются Са2+/Mg2+-зависимая эндонуклеаза, сериновые и цистеиновые протеиназы, циклинзависимые

87

протеинкиназы [Mewes, Ravens, 2004; Golden et al, 1998]. Происходит встраивание продукта протоонкогена bcl-2 в митохондриальную мембрану, что вызывает увеличение ее проницаемости [Lou, Chen, 1998; Kulkarni, McCulloch,

2009].

Перестройка фосфолипидной структуры мембран приводит к экспозиции на поверхности клеток детерминантных групп (например, фосфатидилсерина),

распознаваемых фагоцитами, что способствует быстрому поглощению ими апоптотических клеток [Moir, Zammit, 1995; Fadok et al, 2008].

Вышеперечисленные изменения, в конечном счете, приводят к снижению объема клетки, энергетическому голоду вследствие истощения запасов АТФ

[Bowen, 1990], фрагментации ДНК и образованию апоптотических телец.

Завершается апоптоз фагоцитозом апоптотических телец макрофагами или гистиоцитами. Воспалительная реакция при этом не развивается.

Итак, начальные этапы апоптоза включают как геномные, так и негеномные механизмы действия глюкокортикоидов, складываются из изменения транспорта ионов кальция, калия, активности Na/H-обмена,

снижения трансмембранных потенциалов. Фенотипическим проявлением начальных этапов апоптоза фибробластов является уменьшение их объема. К

фармако-биохимическим маркерам начальных этапов глюкокортикоид-

индуцированного апоптоза могут быть отнесены показатели внутриклеточного значения рН, Са2+, величина митохондриального и плазматического потенциала.

Обобщая результаты, полученные на различных типах клеток, в

зависимости от механизма развития мембранотропные эффекты ГК могут быть разделены на три группы.

I.ГЕНОМ-ОПОСРЕДОВАННЫЕ ЭФФЕКТЫ ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ

ингибирование включения 3Н-тимидина в ДНК;

ингибирование включения 3Н-пролина в коллаген;

88

супрессия ферментативной активности фосфолипазы А2.

Данная группа эффектов характеризуется следующими особенностями:

длительным лаг-периодом (1-2 ч), продолжительным действием (часы-сутки),

зависимостью от синтеза РНК и белка de novo. ГК необходим на этапе

II. НЕГЕНОМНЫЕ МЕМБРАНОТРОПНЫЕ ЭФФЕКТЫ

ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ

изменение базального уровня цАМФ;

модуляция активности мембраносвязанного фермента АЦ;

влияние на базальный уровень свободных ионов кальция.

Котличительными признакам экстраядерных механизмов действия ГК относятся: отсутствие латентного периода, кратковременность эффекта (менее

30 мин), резистентность по отношению к действию ингибиторов синтеза белка и РНК. После удаления ГК из среды инкубации эффект исчезает.

III. СМЕШАННЫЕ ЭФФЕКТЫ ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ

влияние на рецептор-опосредованное повышение концентрации

цАМФ;

действие на индуцированный подъем [Ca2+]вн.

Смешанный механизм действия ГК подразумевает вовлечение генома клетки и экстраядерных путей реализации эффектов глюкокортикоидов.

По-видимому, в условиях in vivo практически все эффекты ГК являются смешанными, поскольку разделение на геномное и негеномное действие возможно только в экспериментальных условиях с использованием фармакологических агентов.

89

На основе собственных результатов и литературных данных предлагаем

классификацию антагонистов глюкокортикоидов, основанную на их способности блокировать мембранные и/или внутриклеточные механизмы гормонального эффекта.

АНТАГОНИСТЫ ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ

Антагонисты мембранного типа действия (прогестерон, 11-

дезоксикортикостерон) отменяют негеномные мембранотропные эффекты глюкокортикоидов, пусковые механизмы которых локализованы на плазматической мембране клеток-мишеней - влияние глюкокортикоидов на уровень цАМФ, ионов кальция, рН, активность Na/H-обмена.

•Антагонисты внутриклеточных рецепторов глюкокортикоидов

(дексаметазон-21-мезилат) препятствуют развитию геномных эффектов кортикостероидов - влиянию глюкокортикоидов на синтез РНК, белка.

• Полные антагонисты глюкокортикоидов (мифепристон) подавляют все типы гормональной активности, опосредованной как мембранными, так и внутриклеточными рецепторами ГК, в том числе смешанные эффекты ГК.

Глюкокортикоиды модулируют трансмембранную передачу внеклеточного сигнала, изменяя сопряжение мембранных рецепторов (Р) с G-белками и эффекторными молекулами (Э). При этом трансдукция активирующего сигнала

– действие митогенов на лимфоидные клетки, активаторов тромбоцитов – ингибируется ГК уже на уровне плазматической мембраны (ПМ). Вторичным посредником активирующего сигнала выступают ионы кальция, их внутриклеточная концентрация увеличивается в 3-5 раз по отношению с