диссертации / 5

72

двухфазное действие. Выявленное различие в действии гормона кортизола и синтетического глюкокортикоида дексаметазона на уровне мембранных рецепторов согласуется с ранее установленными фактами различной чувствительности мебранных рецепторов стероидов к природным гормонам и их синтетическим производным [Сергеев П.В. и др., 1995].

Таким образом, использование препарата кортизола наноразмеров позволило выявить два типа экстрагеномного влияния глюкокортикоидов на фибробласты: 1) потенцирующее действие ГК на эффект AII, реализуемое через минералкортикоидные рецепторы; 2) антагонистический мембранотропный глюкокортикоидов, выявляемый при использовании фармакологических концентраций стероидов.

Можно предположить, что применение наноразмерного кортизол-

полимерного комплекса позволит избирательно регулировать функциональную активность фибробластов на уровне мембранной рецепторной системы, что открывает новые предпосылки дальнейшей эволюции топических глюкокортикоидов, применяемых в дерматологии, с помощью наноразмерного дизайна оригинальных молекулярных комплексов.

4.3.3. Молекулярные механизмы влияния наноразмерного кортизолполимерного комплекса на обмен вторичных мессенжеров в культуре фибробластов кожи.

В задачи данного раздела работы входило изучение мембранотропных эффектов глюкокортикоидов на систему вторичных мессенджеров в фибробластах кожи.

Одним из критериев, свидетельствующих о чувствительности клеток к ГК,

является антипролиферативное действие гормонов, которое обусловлено их способностью ингибировать ранние этапы активации клеток. К таким ранним этапам относятся изменения в системе вторичных мессенджеров (Са2+; цАМФ),

являющиеся триггерными пусковым механизмам активации и деления клеток.

Внутриклеточный уровень ионов кальция ([Са2+]цит) в покоящихся клетках не превышал значения 110 нМ (98 12 нМ). Внесение в суспензию

73

клеток 3 мкМ наноразмерного кортизол-полимерного комплекса (НР-ГК) (соответствует средней терапевтической концентрации гидрокортизона в дерме при топическом применении) не приводило к достоверному изменению концентрации Са2+.

В качестве стимуляторов активации фибробластов кожи в нашей работе был использован ангиотензин II (AII). Добавление к фибробластам 100 нМ АII

вызывало быстрое увеличение [Са2+]цит до 240 25 нМ (р <0,05). Для того,

чтобы определить, откуда ионы кальция поступают в цитоплазму клеток при действии АII, были проведены эксперименты в бескальциевой среде. Ca2+ в

инкубационной среде связывали ЭГТА (конечная концентрация 1 мкМ), что приводило к резкому снижению базального уровня флуоресценции (рис. 24,б).

АII (100 нМ) на фоне ЭГТА вызывала увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция примерно на 55 12 нМ (р<0,05), что примерно в два раза меньше реакции, наблюдаемой в инкубационной среде с нормальным содержанием ионов кальция. Данный факт, а также характерная кинетика Са-

ответа на АII в среде без кальция позволяют предположить, что ангиотензин II

индуцирует выход ионов кальция из внутриклеточных депо клеток. Если в среде с ионами Ca2+ на фоне действия АII к суспензии клеток добавляли ЕGТА

(1 мМ), наблюдалось резкое снижение уровня [Ca2+]цит (рис. 24,а), который восстанавливался при добавлении CaCl2 за счет поступления ионов кальция через каналы плазматических мембран. Таким образом, при действии АА на фибробласты Са-ответ является суперпозицией двух процессов: транспорта ионов Са из инкубационной среды в цитоплазму, а также выхода Ca2+ из внутриклеточных депо.

74

Рис. 24. Влияние ЭГТА на индуцированное ангиотензином II (АII)

повышение уровня [Са2+]цит в среде, содержащей 1 мМ CaCl2 (а) и в бескальциевом буфере (б).

Обозначения: 1 - АII (100 нМ), 2 – ЭГТА (1 мM), 3 - CaCl2 (4.5 mM).

Добавление АII (100 нМ) на фоне действия НР-ГК (3 мкМ) приводило к росту [Ca2+]цит на 52 ± 13 нМ (р<0,02) от базального уровня, что напоминает увеличение Ca2+ в бескальциевой среде (рис. 25). Полученные результаты свидетельствуют о том, что в терапевтической области концентраций наноразмерный кортизол-полимерный комплекс блокирует Са-каналы плазматических мембран и препятствует индуцированному ангиотензинном II

входу Ca2+ извне в клетки. В то же время наноразмерный кортизол-полимерный комплекс практически не влияет на стимулированный АII выход Ca2+ из внутриклеточных депо.

Исследование аденилатциклазного звена клеточного ответа фибробластов показало, что базальный уровень цАМФ составил в среднем 2.3 ± 0,6 пмоль/107

клеток (n=10). При определении влияния АII на содержание цАМФ в фибробластах были обнаружены значительные индивидуальные различия.

Добавление к суспензии фибробластов АII (100 нМ) в одних случаях (7

наблюдений) приводило к достоверному снижению уровня цАМФ (1.2 ± 0,4

пмоль/107 клеток), в других (6 наблюдений) вызывало увеличение

75

внутриклеточной концентрации цАМФ (3.1 ± 0,4 пмоль/107 клеток).

Исследование влияния наноразмерного кортизол-полимерного комплекса

(3мкМ) на цАМФ-ответ клеток не позволило выявить какие-либо закономерности.

Рис. 25. Влияние ангиотензина II (АII) на уровень ионов кальция в фибробластах на фоне действия НР-ГК. Условия и обозначения как на рис. 1.

полимерный комплекс (3 мкМ).

Полученные нами данные свидетельствуют, что наноразмерный кортизол-

полимерный комплекс в концентрации 3 мкМ подавлял индуцированное увеличение [Са2+]цит и не влиял на базальный уровень кальция в фибробластах.

Для проявления Са-блокирующего эффекта НР-ГК латентный период не требовался. Механизмы регуляции активности клеток-мишеней, включающие аденилатциклазную систему, по-видимому, не являются точкой приложения негеномного действия ГК.

В качестве индикатора чувствительности фибробластов к ГК использовали интенсивность включения меченого пролина в коллаген.

Применение меченых предшественников - классический прием для выявления действия изучаемых соединений на клеточный ответ фибробластов [Abe A.,

76 1995]. Гидрокортизон (10-6 М) и преднизолон (10-6 М) после 8 ч инкубации угнетали накопление меченого предшественника на 32,3% и 45,1%

соответственно (рис. 26).

С увеличением концентрации гормонов различия нивелировались: если в концентрации 3 мкМ преднизолон ингибировал включение 3Н-пролина в 1,2

раза сильнее гидрокортизона, то в концентрации 25 мкМ достоверных различий в действии гормонов не отмечено. Таким образом, при повышении концентрации наряду с геномным эффектом проявляется негеномный, более выраженный у природного кортикостероида гидрокортизона. При исследовании сочетанного действия ГК (3*106 М) и циклогексимида (30*106 М)

установлено, что циклогексимид частично подавлял действие ГК.

Рис. 26. Влияние гидрокортизона и преднизолона на включение 3Н- пролина в коллаген фибробластов.

По оси ординат - количество включенного 3Н-пролин, %.

Обозначения: 1 - контроль; 2 - концентрация ГК в среде инкубации 1 мкМ; 3 - 3

мкМ; 4 - 10 мкМ; 5 - 3 мкМ+циклогексимид 30 мкМ. Условия: время инкубации 8 часов, t=370С.

Полученные результаты свидетельствуют о геном-опосредованном влиянии ГК на включение меченого предшественника в коллаген

77

фибробластов, поскольку эффект кортикостероидов проявлялся как минимум через 2 ч и ингибировался блокатором синтеза белка циклогексимидом.

Итак, одним и перспективных направлений для дальнейшего совершенствования препаратов топических стероидов является создание средств с преимущественно внегеномным механизмом действия. По нашим данным, именно это позволит повысить их клиническую эффективность и уменьшить потенциальную возможность развития нежелательного действия на кожу. Один из потенциальных путей разработки новых глюкокортикоидных препаратов включает разделение геномных и негеномных эффектов за счет модификация фармакологических свойств глюкокортикоидов на основе использования наноразмерных полимеров.

78

Раздел IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Стимулом к активному изучению молекулярных механизмов действия глюкокортикоидных гормонов послужило внедрение в практику радиолигандного анализа. С использованием меченных тритием стероидов в гомогенате печени, а потом и в других органах-мишенях глюкокортикоидных гормонов, были обнаружены белки, с высоким сродством и селективностью связывающие стероидные молекулы. Поскольку гормонсвязывающие белки впервые были выявлены в растворимой фракции гомогенатов они получили название «цитозольных рецепторов глюкокортикоидных гормонов».

На основе дальнейшего изучения молекулярных и физико-химических свойств рецепторов была сформулирована двухэтапная модель действия стероидов. Согласно данной концепции, глюкокортикоидные гормоны путем простой диффузии проникают в компетентную клетку и связываются цитозольными рецепторами. Образовавшиеся гормон-рецепторные комплексы активируются, приобретая способность транслоцироваться в ядро, инициируют экспрессию генов, что, в конечном счете, приводит к синтезу специфических белков, определяющих ответ клетки на гормональный сигнал. Таким образом,

плазматической мембране (ПМ) в указанной схеме отводилась пассивная роль.

С привлечением новых методов исследования и развитием теории избирательности действия лекарственных веществ в течение последних 10-15

лет накоплен значительный экспериментальный материал, расширяющий представления о действии глюкокортикоидных гормонов.

Для идентификации и количественной характеристики мембранных участков связывания глюкокортикоидов были применены классические препаративные биохимические методы и радиолигандный анализ. Именно таким путем в ПМ клеток-мишеней обнаружены специфические места связывания для всех классов стероидных гормонов - эстрогенов, прогестинов,

глюкокортикоидов и минералкортикоидов. В цитоплазматических мембранах выявлены две системы, связывающие стероиды: одна из них характеризуется

79

насыщением, высоким сродством и специфичностью к тропным гормонам;

вторая - отличается ненасыщаемостью, низким сродством и отсутствием специфичности. Для определения химической природы данных «систем узнавания» были проведены предварительные обработки. Так, преинкубация гепатоцитов или их плазматических мембран с блокатором SH-групп парахлормеркурибензоатом, протеолитическими ферментами (проназой,

папаином) значительно снижала включение глюкокортикоидных гормонов.

Важно отметить, что способность цитозольных рецепторов связывать стероиды в этих услових не изменялась. В отношении биологической роли найденной специфической системы связывания глюкокортикоидных гормонов существует несколько мнений. Часть авторов, принимая во внимание низкую скорость диссоциации образующихся гормон-рецепторных комплексов, отводит мембранным белкам, связывающим стероиды, функцию транспорта гормонов через ПМ. Другие исследователи полагают, что эта система представляет собой мембраносвязанные ферменты метаболизма стероидов, в частности,

когда имеется в виду ПМ гепатоцитов.

Следующим этапом в дискуссии между сторонниками мембранного этапа в механизме действия глюкокортикоидных гормонов и приверженцами классической схемы действия стероидов стали взаимные упреки в "нечистоте"

экспериментов. Действительно, современные биохимические методики не позволяют выделить из гомогената чистые препараты мембранной или цитозольной фракций клеток. Степень очистки, определяемая по активности маркерных ферментов ПМ (5'-нуклеотидаза) и цитоплазмы (кетозо-1-фосфат-

альдолаза), в представленных работах составляет от 15 до 50 раз (отношение удельной активности фермента в конечном препарате к таковой в исходном гомогенате). Следовательно, наличие мембранных участков связывания глюкокортикоидных гормонов может определяться примесью цитозольной фракции и наоборот.

Казалось точку в этом споре должны были поставить работы, в которых использовались авторадиографический и иммунногистохимический методы,