диссертации / 5

ресценции. Значение Кдисс -равновесной константы диссоциации Fura-2 с Ca2+ - оп-

ределяли в модельных опытах, используя раствор Fura-2. Рассчитанная с помощью анализа Скетчарда величина Кдисс составила 140 нМ.

Для определения Rmax плазматическую мембрану фибробластов, содержа-

щихся в среде с насыщающей для FURA концентрацией Са2+ (более 1000 Kd),

разрушали 40 мкМ дигитонином, разрушающим мембрану с высоким содержанием

холестерина, которой является плазматическая мембрана клетки (в отличии от

мембраны внутриклеточных органелл). Rmin определяли, добавляя после этого 5

мМ MnCl2, который вытесняет Са2+ из комплекса с красителем (рис. 14). В нашем

при 500 нм, длина волны возбуждения 380 нм; k - отношение интенсвности флуо-

С увеличением продолжительности инкубационного периода от 10 до 40 мин изменения спектра флуоресценции отражают повышение содержания в клетках комплекса зонд-кальций, одновременно снижается уровень несвязанного с Са2+

FURA-2. Дальнейшее увеличение времени инкубации при приводило к достоверно-

му изменению интенсивности флуоресценции. Таким образом, 40 мин - оптималь-

ная продолжительность нагружения фибробластов зондом FURA-2/AM.

Рис. 14. Изменение спектра возбуждения флуоресценции нагруженных FURA- 2/AM фибробластов от времени предварительной инкубации с зондом.

Обозначения: 1 - 0 мин; 2 - 15 мин; 3 - 30 мин; 4 - 40 мин; 5 - 60 мин; 6 - аутоф-

луоресценция фибробластов (10-15 млн/мл).

Рис.15. Изменение спектра возбуждения флуоресценции нагруженных FURA-2/AM

клеток в присутствии 40 мкМ дигитонина (1); 5 мМ МnCl2 (3); контрольный образец

(2).

3.5. Определение параметров специфического связывания глюкокортикоидов фиб-

робластами.

I. Изучение характера связывания меченых полимерных аналогов глюкокортикои-

дов проводили по следующей схеме.

0,2 мл суспензии клеток (10-20 106 кл/мл) инкубировали при 40С в течение 1 часа в присутствии 14С-ПВП-кортизола или 14С-ПВП-преднизоло-на. Их концентрация в среде инкубации составляла от 0,1 до 5 10-6 М. Для определения неспецифическо-

го связывания в пробы с 14С -ПВП-ГК вносили 1000-кратный избыток немеченых свободных гормонов: кортизола или преднизолона. Далее содержимое проб пере-

носили на фильтры GF/C "Whatman" и дважды отмывали их 5 мл HEPES-буфера

(t=4 C). После высушивания фильтры помещали в сцинтилляционные флаконы для последующей радиометрии.

Количество специфических мест связывания на плазматической мембране определяли с учетом эффективности счета и удельной радиоактивности 14С-ПВП-

аналогов. Специфическое связывание вычисляли как разницу между количеством связанных клетками полимеров в отсутствии немеченых гормонов (общее связыва-

ние) и количеством 14С -ПВП-аналогов, связанных клетками в присутствии 1000-

кратного избытка немеченых свободных гормонов (неспецифическое связывание).

II. Исследование связывания меченых ГК внутриклеточными рецепторами фиброб-

ластов. 0,2 мл суспензии клеток (10-20 106 кл/мл) инкубировали в течение часа при 40С в присутствии 3Н-кортизола или 3Н-преднизолона ( конечная кон-

центрация 2-30 нМ): без этих препаратов (контроль) и в присутствии 100-

кратного избытка немеченых аналогов гормонов. Анализ содержания внутрикле-

точных рецепторов проводили по методике Lippman (1978). К суспензии клеток добавлялся дигитонин в конечной концентрации 50 мкМ, который вызывал разру-

шение мембраны. Для определения цитоплазматического связывания 3Н-гормонов

держащие 100 мкл 1,5 мМ MgCl2 в растворе декстран-покрытого угля, тщательно перемешивали и оставляли на 15 минут. Далее пробы центрифугировали (15000g, 10 мин) и супернатант радиометрировали.

3.6. Определение включения 3Н-тимидина в ДНК фибробластов.

Интенсивность биосинтеза ДНК в фибробластах оценивали по включению 3Н-

тимидина в ДНК клеток по следующей методике. К 0,5 мл клеточной суспензии фибробластов в среде 199 с эмбриональной сывороткой (3 млн клеток в 1 мл сус-

пензии) добавляли 20 мкл раствора гормона (конечная концентрация кортизола и преднизолона в пробах 10-6 М) , после чего клетки инкубировали при температуре

37 С в течение 24 часов. При исследовании сочетанного действия ГК гормонов и лигандов пуриновых рецепторов препараты вносили одновременно (конечная кон-

центрация в пробах аденозина 10-6 М, азатиоприна и 6-меркаптопурина 10-5 М). В

контрольных пробах клетки инкубировали без стероида. Через 24 часа в каждую пробирку вносили по 2 мкКи 3Н-тимидина в объеме 10 мкл. Пробы инкубировали еще 1 час, затем пробирки охлаждали до 4 С и центрифугировали (3000 g, 10 мин).

К осадку добавляли 3 мл 5% раствора предварительно охлажденной до 4 С трихло-

руксусной кислоты (ТХУ). Полученную суспензию центрифугировали (3000 g, 10

мин) и дважды отмывали в 3 мл раствора ТХУ. Makman M.H. и соавт. (1968) пока-

зали, что образующийся в результате материал (осаждаемый ТХУ) состоит из пре-

ципитированной 3Н-тимидин-ДНК. Полученный после центрифугирования осадок переносили во флаконы для определения содержания меченого тимидина мето-

дом жидкостной радиометрии.

3.7. Радиоиндикаторный метод определения внутриклеточного уровня цАМФ.

Метод основан на конкуренции за связывание с белком немеченого цАМФ, содер-

жащегося в исследуемом материале или стандартной пробе, с известным количест-

вом меченого тритием цАМФ (Brown et al., 1971). Радиоактивность связанного с

белком меченого цАМФ обратно пропорциональна количеству немеченого цАМФ в тестируемом материале. На этом основано построение соответствующей стандарт-

ной кривой и расчет концентрации цАМФ.

Ход определения цАМФ включал инкубацию со связывающим белком, разделение свободного и связанного с белком цАМФ, измерение радиоактивности и подсчет полученных результатов исследования. Для определения содержания цАМФ ис-

пользовали стандартный набор реактивов фирмы "Amersham" (Англия) с соблюде-

нием условий и требований, указанных в прилагаемой инструкции. При подведе-

нии окончательного результата производился пересчет на соответствующее число клеток (106 фибробластов).

3.8. Жидкостная сцинтилляционная радиометрия.

Воснове метода лежит свойство бета-частиц вызывать сцинтилляцию веществ

вспециальных средах. Это дает возможность с большой эффективностью регист-

рировать бета-излучение, обладающее малой энергией.

Для регистрации радиоактивности образец на фильтре помещали в 5 мл сцинтилляционной жидкости. Ее состав: РРО (2,5-дифенилоксазол) - 4 г, РОРОР

(1,4-бис-2-метил-5-фенилоксазолилбензол) - 0,4 г, толуол - до 1 литра. Смесь тща-

тельно перемешивали и радиоактивность образца регистрировали на жидкостном сцинтилляционном радиометре SL-30 "Intertechnique" (Франция). Эффективность счета для 3Н составляла 20-25%, для 14С - 70% (в среднем).

3.9. Статистическая обработка результатов.

Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью пакета приклад-

ных программ Pharmacological Basic Statistics. Расчет доверительных интервалов экспериментальных значений и оценку достоверности различий между ними про-

водили с использованием непараметрического парного критерия Вилкоксона-

Манни-Уитни (при обработке данных опытов in vivo) и t-критерия Стьюдента (в

опытах in vitro) при уровне значимости Р=0,05. Экспериментальные данные пред-

ставляли в виде среднее значение доверительный интервал.

56

Раздел IV. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 4.1. Идентификация и изучение свойств специфических «систем узнавания», локализованных на плазматических мембранах фибробластов кожи.

С помощью радиолигандного метода изучали связывание иммобилизованных

на полимере глюкокортикоидов клетками в присутствии различных немеченых стероидных гормонов. Особенностью данных экспериментов по сравнению с

проведенными ранее явилось возможность определения количества связанного

клетками полимерного препарата, в состав которого включен радиоактивный изотоп углерода 14С (сополимер 14С-винилпирролидона с глюкокортикоидом).

С помощью меченых С-НР-аналогов глюкокортикоидов (14С-НР-

кортизола, 14С- НР-дексаметазона и 14С- НР-преднизолона) нами были

идентифицированы специфические участки связывания ГК, локализованные на

используемых концентраций (0,5-5х10-7 М) отражает полное насыщение

представлены в обратных координатах Лайнуивера-Берка (рис. 17). Графики описываются уравнениями: y = 0,44 + 0,66х, у = 0,56 + 2,15х и у = 0,51 + 1,96х

соответственно. Для количественной характеристики взаимодействия 14С-НР-

ГК с мембранными участками связывания полученные результаты были представлены в обратных координатах Лайнуивера-Берка (рис. 17). Графики описываются уравнениями: y = 0,44 + 0,66х, у = 0,56 + 2,15х и у = 0,51 + 1,96х

соответственно.

57

Рис.16. Специфическое связывание 14С-НР-кортизола фибробластами, представленное в прямых координатах.

Обозначения: В - количество связанного 14С-НР-ГК, (имп/мин)/106 клеток. С - концентрация 14С-НР-ГК в инкубационной среде, М.

Прямолинейный вид графика для всех НР-аналогов свидетельствует о наличии одного типа мест связывания для гормонов на мембране фибробластов, что подтверждается литературными данными [Гуковская А.С.,

Зинченко В.П., 1986].

58

Рис. 17. Специфическое связывание 14С-НР-кортизола (А) и 14С-НР- преднизолона (В), представленное в обратных координатах.

Обозначения как на рис.16.

С помощью стандартных программ математического обеспечения для рассчитаны численные значения числа мест связывания (Bmax) и констант диссоциации (Кd) НР-ГК, которые составили:

для 14С-НР-кортизола: Кд = 0,15 0,02 мкМ, Вmax = 3,7 0,3 пмоль/мг белка или 85000 мест на клетку (при расчете количества мест связывания на клетку взята средняя величина);

для 14С-НР-преднизолона: Кд = 0,38 0,04 мкМ и Вmax = 3,6 0,5 пмоль/мг белка (77000 мест на клетку);

для 14С-НР-дексаметазона: Кд = 0,45 0,05 мкМ и Вmax = 3,6 0,5 пмоль/мг белка (81000 мест на клетку).

Вычисленные значения параметров специфических «систем узнавания» глюкокортикоидов, локализованных на плазматических мембранах фибробластов суммированы в табл. 7.

59

Таблица 7. Параметры специфического связывания глюкокортикоидов

фибробластами.

фибробластами позволил установить его специфичность. Связывающая способность участков, взаимодействующих с иммобилизованным на полимере кортизолом, уменьшается в ряду: кортизол кортикостерон > прогестерон > 11-ДОК > преднизолон > дексаметазон >> тестостерон > эстрадиол .

Поливинилпирролидон и НР-холестерин не влияли на специфическое связывание НР-кортизола клетками. Отсутствие конкуренции указывает на неспецифический характер взаимодействия и отсутствие насыщаемости

плазматических мембран фибробластов для холестерина и винилпирролидона.

дексаметазона изучены параметры связывания меченых ГК внутриклеточными рецепторами. Для исключения возможности взаимодействия глюкокортикоидов с мембранными участками связывания плазматическую мембрану фибробластов разрушали путем добавления к суспензии клеток дигитонина до

концентрация связанного лиганда, по оси ординат - отношение связанного меченого гормона к концентрации свободного. Графики описываются