диссертации / 5

20

деацетилирование гистонов хромосом, приводящее к уплотнению структуры хроматина и ограничению доступа к ДНК факторов транскрипции [Tang Y, DeFranco DB., 1996; Reichardt HM et al., 1998]

Также помимо непосредственного влияния на процесс транскрипции генов,

топические глюкокортикоиды, по-видимому, могут оказывать влияние на стабильность матричной РНК, уменьшая ее стабильность на посттранскрипционном уровне, и на продукцию воспалительных белков в рибосомах в процессе трансляции. Экспериментально подтверждено, что это является одним из механизмов снижения синтеза ИЛ-1,6, циклоксигеназы,

гранулоцитально-макрофагального колониестимулирующего фактора, фактора некроза опухоли [Tryc AB et al., 2006].

Описанный выше механизм действия глюкокортикоидов лежит в основе их действия на различные клетки (табл.2).

Таблица 2. Влияние глюкокортикоидов на клетки, принимающие участие в

Смешанный механизм действия глюкокортикоидов подразумевает вовлечение генома клетки и экстраядерных путей реализации эффектов глюкокортикоидов.

По-видимому, в условиях in vivo практически все эффекты глюкокортикоидов являются смешанными, посколку разделение на геномный и внегеномный эффекты возможно лишь в экспериментальных условиях с использованием фармакологических агентов.

Глава 2.2. Методы модификации лекарственных средств на наноуровне.

Нанофармакология располагает рядом методов модификации лекарственных средств на наномолекулярном уровне (условно говоря, в диапазоне 1-100нм) с

целью придания им некоторых необходимых исследователю свойств.

ПЭГ-конъюгация.

Рис. 4. Основные достоинства ПЭГ [Abuchowski, A et al., 1997].

ПЭГ-конъюгация (ПЭГК), или пэгилирование, впервые была описана в семидесятых Davies и Abbuchowsky на примере каталазы и альбумина. В

настоящее время это метод интенсивно развивается и располагает множеством заслуживающих внимания вариаций. Мы рассмотрим основные. Что дает ПЭГК? Рассмотрим этот вопрос на примере белка. 1. ПЭГК увеличивает растворимость за счет собственной гидрофильности. 2.ПЭГК увеличивает размер и массу частицы, снижая таким образом интенсивность почечной экскреции. 3. ПЭГК снижает доступность для протеолитических ферментов и антител. (рис.4).

Совершенствование методов конъюгации привело к появлению подходов к специфической конъюгации определенных химических группировок, что позволяет избежать появления смеси изомеров. К тому же, сайт-специфическая конъюгация позволяет лучшим образом сохранить нативную конформацию

22

белковой молекулы. Метод, предложенный Kinstler и соавт. (1996), использует преимущество низкого pKa N-концевой аминогруппы и ε-аминогруппы лизина.

С помощью восстановительного алкилирования ПЭГ-альдегидом был получен ПЭГ-Г-КСФ (Pegfilgrastim®).

Также возможно, защитить активный центр фермента или центр узнавания белка, осуществляя ПЭГК в присутствии специфического обратимого ингибитора, субстрата или лиганда с последующим снятием защиты. Такие лиганды могут быть свободно находиться в растворе или быть прикреплены к нерастворимым носителям.

Существует альтернативный двухступенчатый метод ПЭГК, обеспечивающий присоединение ПЭГ к определенным аминам в пептиде. Идея метода заключается в обратимой защите некоторых остатков с целью предотвратить их модификацию. Хотя такой подход был успешно применен для инсулиновых и СТГ аналогов, он не подходит для всех белков, так как в процессе создания защиты и снятия ее может быть изменена структура протеина, приведя к его биологически неактивному производному.

Недостатки метода.

1. ПЭГ, как и все искусственные полимеры, является полидисперсным, то есть его цепи содержат разное количество мономеров, появляющихся в ходе химического синтеза. Их концентрации подчиняются распределению Гаусса в соответствии с их молекулярными массами. В конечном итоге это приводит к образованию смеси конъюгатов, которые могут обладать разными биологическими свойствами, что главным образом отражается на времени полужизни оных молекул и их иммуногенности. В настоящее время благодаря развитию химических технологий возможно получение ПЭГ с относительно низким уровнем полидисперсности. Однако об этой проблеме не следует забывать, особенно при работе с низкомолекулярными препаратами, когда масса ПЭГ оказывает весьма значимое влияние на свойства конъюгата,

зависящие главным образом от веса частиц.

2. Вторая проблема связана с особенностями экскреции ПЭГ конъюгатов. Как и другие полимеры ПЭГ элиминируются с мочой и калом, но в больших количествах могут накапливаться в печени, приводя к развитию макромолекулярного синдрома. Кроме того, нельзя экстраполировать на ПЭГ интенсивность почечной фильтрации, ориентируясь лишь на ее величину для белков (≈ 60кД, альбумин), так как существует ряд факторов, оказывающих в той или иной степени влияние на данный процесс и не имеющих своей силы в случае протеинов. Необходимо учитывать, что за счет высокой гигроскопичности, ПЭГ покрыт толстой гидратной оболочкой, из-за чего гидродинамический объем молекулы в 3-5 раз больше объема белка той же массы. Кроме того, подвижность отдельных связей в ПЭГ обеспечивает проникновение через гломерулярную мембрану полимера. В любом случае,

почечная фильтрация зависит главным образом от массы частицы (порог молекулярной массы– 65кДа),а более крупные молекулы выводятся преимущественно с калом. Также ПЭГ может метаболизироватьься

ферментативно с помощью CYP450, алкогольдегидрогеназы и

неферментативно, благодаря anchimeric-assisted механизму гидролиза, в

данном случае триггерами этого процесса являются амидные группировки. В

настоящее время используют ПЭГ массой до 40 кДа.

3. В процессе конъюгации белок теряет свою нативную структуру. А изменение трехмерной упаковки ведет к потере в той или иной степени биологической активности протеина. Однако, в настоящее время известны примеры успешной ПЭГК для белков и пептидов. И имеются коммерческие препараты данных конъюгатов, одобренные FDA. К примеру ПЭГ-ИФНα (Pegasys®), который сохраняет лишь 7 % от биологической активности нативного ИФНα. Несмотря на это конъюгат in vivo оказался значительно более эффективен, чем неконъюгированный ИФНα, за счет улучшенных фармакокинетических свойств.

ПЭГК низкомолекулярных веществ. Основные проблемы, связанные с

24

разработкой низкомолекулярных препаратов, особенно противоопухолевых средств, касаются их низкой растворимости, быстрой экскреции и неспецифическим распределением в организме. Все эти недостатки можно корректировать с помощью ПЭГК. Описаны конъюгаты таких веществ как таксол, камптотецин, соль Пейроне и доксорубицин. Но с применением ПЭГ для низкомолекулярных веществ связаны следующие вопросы. Ведь в таких веществах число функциональных группировок, к которым можно присоединить полимер, очень мало. Таким образом, ПЭГ не способен экранировать в должной степени молекулу, и КПД такой процедуры сводится к нулю. С другой стороны низкомолекулярное вещество не имеет конформационных, функционально значимых вариаций, свойственных белкам,

что обусловлено особенностью их строения. Кроме того, очищение конъюгатов низкомолекулярных веществ и их описание также проще. Многие исследователи используют ПЭГК низкомолекулярных соединений для пассивной избирательной доставки ЛС в твердые опухолевые образования за счет EPR эффекта (Enhanced Permeability and Retention effect), эффекта увеличенной проницаемости и удерживания или лишь для модификации кинетики. Конъюгаты обычно относят к пролекарствам, так как для их активации требуется отщепление от полимера. Не так давно были разработаны методы, обеспечивающие высвобождение активного лекарства вопределенных условиях и соответствующих клеточных/организменных компартментах.

Можно использовать для этих целей низкий рН эндосом, к примеру соединив полимер и активное вещество N-цис аконитовой кислотой или гидразоновым мостиком, или действие лизосомальных ферментов, соединив молекулу активного вещества и полимера олигопептидом, к примеру –G-F-L-G-OH или –

G-L-F-G-OH.

Чтобы решить основную проблему – наличие одного-двух гидроксильных остатка в молекуле лекарственного вещества, исследователи прибегают к синтезу дендримерных структур, о которых пойдет речь ниже.

Таким образом, ПЭГ в общем случае:

1.Увеличивает растворимость ЛС, корректирует его заряд, увеличивает молекулярную массу, время полужизни. В случае противоопухолевых препаратов имеет значение EPR эффект;

2.Обеспечивает защиту ЛС от взаимодействий с протеазами, нуклеазами и АТ,

таким образом уменьшая иммуногенность препаратов, что важно в случае введения негомологичных белков.

И в заключение приведем некоторые примеры одобренных FDA препаратов

(табл.3).

Таблица 3. Примеры наноразмерных лекарственных препаратов, одобренных

FDA.

Дендримеры.

Дендримеры представляют собой синтетические каскадно-разветвленные древообразные, поливалентные и монодисперсные структуры.

Они имеют сердцевину, из которой берут свое начало дендроны (кроны),

образующие в дальнейшем повторяющиеся и разветвляющиеся единицы,

дающие в свою очередь несколько генераций (рис.5). На концах своих дендримеры имеют поверхностно-активные, терминальные группировки.

Таким образом «…ключевыми параметрами, определяющими строение и размер макромолекул дендримера, являются Nc - индекс ветвления ядра, то есть число дендронов (крон), растущих из ядра макромолекулы; Nb - индекс

26

ветвления звеньев - число ветвей, образуемых каждой повторяющейся единицей; G - номер генерации…» [Семчиков Ю.Д., 1998]. Количество генераций и структура элементарной единицы определяет размер, форму,

валентность, растворимость дендримера и другие его ф/х свойства.

Каждое звено заканчивается узлом ветвления, образуемым в данном случае одной из групп NH2 диамина (Б). Узлы ветвлений, замыкающие последовательности из одинакового количества звеньев, образуют генерации или слои разветвлений. Функциональные группы, вызывающие разветвления (в

данном случае NH2), расположенные на периферии дендримера, называются терминальными. Число терминальных групп возрастает в геометрической прогрессии при увеличении числа слоев (генераций) дендримера…»

Рис. 5. Схематическая иллюстрация возможных методов ассоциации ЛС с дендримером. (а) инкапсулированное ЛС, (b) ковалентно связанное ЛС, (c) нековалентно связанное ЛС.

Использование ПАМАМд возможно для придания необходимых ФК и ФД свойств лекарственным средствам. Гидрофобная сердцевина является потенциальным местом ассоциации с гидрофобным соединением. Окончания веточек также могут быть местом взаимодействия дендримера и лекарственного средства либо за счет кулоновских сил с образованием своего рода комплекса, либо за счет валентных связей через соответствующие мостики и образованием конъюгата. Причем возможно присоединение как молекул лекарственного средства, так и молекул другого функционального назначения, к примеру, обеспечивающих активную прицельную доставку препарата. Так или иначе связанные с дендримерами лекарственные средства

имеют фармакокинетические и фармакодинамические свойства

принципиально отличные от таковых для свободных молекул лекарственного средства, при условии, что взаимосвязь между дендримером и лекарственным средством достаточно прочна (рис.5).

При размещении гидрофобного соединения в гидрофобном ядре дендримера образуется своего рода агрегат, комплекс гость-хозяин, в котором капсула дендримера обеспечит прекрасную растворимость и стабильность гостю -

лекарственному средству. Модификация химически активных поверхностных группировок делает возможным изменение in vivo таких параметров как сайт-

специфичность, уровень деградации, время полужизни препарата и его токсичность. Таким образом возможны следующие манипуляции с дендримером:

1. Нековалентное связывание с лекарственным средством за счет а)

гидрофобных взаимодействий с образованием агрегата, б)электростатических взаимодействий с образованием комплекса;

2. Ковалентное связывание с лекарственным средством с образованием конъюгата а) напрямую, б) через специальный линкер (мостик).

Отдельно необходимо выделить функционально различающиеся классы присоединяемых различным образом к дендримеру молекул:

фармацевтические препараты, молекулы-адрессаты, хромофоры,

радиологически активные молекулы, поверхностно активные молекулы.

В общем случае использование дендримеров дает ряд преимуществ: (1)

высокую плотность и активность терминальных группировок на поверхности частицы и возможность их модификации, (2) контролируемую форму,

задаваемую Мr, монодисперсность частиц и, следовательно, хорошую воспроизводимость фармакокинетического профиля, (3) определенный размер

(зависящий от генерации), удовлетворяющий различным биомедицинским замыслам, (4) высокие проникающие способности частицы через плазматическую мембрану, что приводит в свою очередь к высокому уровню захвата ЛС, связанных с частицами, (5) отсутствие иммуногенных свойств у

28

дендримеров делает их применение более безопасным, нежели синтезированных пептидных переносчиков или белковых переносчиков, (6)

наличие EPR эффекта, обеспечивающего пассивно направленную доставку ЛС в опухолевую ткань, (7) возможность присоединения к дендримерам функционально активных молекул, таких как антитела (АТ), хромофоры,

радионуклиды с образованием частиц различной направленности применения,

(8) постоянное и равномерное образование активного лекарственного средства из пролекарства обеспечивает снижение токсичности частиц, увеличение накопления препарата и его пролонгированное действие.

В настоящее время ведутся разработки по модификации различных ЛС с помощью дендримеров. Наиболее интенсивно разрабатываются модификации следующих классов ЛС: НПВС, противомикробные и противовирусные препараты, противоопухолевые средства (цитостатики, радионуклиды,

фоточувствительные соединения), что объяснимо не только особенностями их ф/х свойств, но и эпидемиологической значимостью соответствующих патологий.

Так как большинство НПВС - гидрофобные молекулы, имеющие карбоксильную группу, положительно заряженные дендримеры

(модифицированные аминогруппами) являются потенциальными кандидатами на роль их переносчиков. В настоящее время комплексы НПВС-дендример -

наиболее активно исследуемые препараты из всех комплексов дендримеров.

Аспирин, индометацин, флурбипрофен, кетопрофен, ибупрофен, напроксен,

дифлунизал, диклофенак натрий и пироксикам – были успешно тем или иным образом связаны с модифицированными аминами ПАМАМд или ППИд и испытаны рядом исследовательских групп. В частности недавно были получены данные об активности комплекса дендримера и доксорубицина, по эффективности сравнимого с одобренной FDA эмульсией из раствора липосом,

груженных доксорубицином.

Ниже приведены таблицы с некоторыми результатами испытаний комплексов

Таблица. 4. Фармакокинетические и вармакодинамические эффекты конъюгации некоторых НПВС с дендримерами.

Примечания. AUC – площадь под фармакокинетической кривой.

Таблица 5. Влияние дендримеров на терапевтическую активность некоторых противоопухолевых прпаратов.

Сообщается о синтезе пролекарства ацетилсалицилата на основе G1-3

дендримеров. К сожалению данных о его испытаниях in vivo пока нет.

Существуют данные о противовоспалительной активности ПЭО-

гликодендримеров. Необходимо отметить и о других потенциально возможных применениях дендримеров, связанных с присоединением к их оболочке биологически функциональных молекул различного назначения,