диссертации / 5

печени) и быстро выводится из организма. Галогенизированные стероиды медленно метаболизируются, плохо связываются с транспортным белком транскортином и медленно выводятся. Период полувыведения галогенизированных препаратов в 2-3 раза больше, чем у естественного гидрокортизона. Поэтому даже при малом всасывании через кожу галогенизированные стероиды могут оказывать системные эффекты,

поскольку в крови может длительно циркулировать активный препарат в свободной (несвязанной с транскортином) форме.

Базируясь на этих фундаментальных данных, был проведен направленный поиск топических кортикостероидов с улучшенным соотношением «польза-

риск», которые были бы также эффективны, как галогенизированные, но при этом более безопасны. В 90-е годы были созданы препараты нового поколения

– «диссоциированные» кортикостероиды, для которых характерна высокая местная противовоспалительная активность при пренебрежимо малом системном эффекте (наиболее оптимальным соотношение между терапевтическими и побочными эффектами оказалось у топического стероида метилпреднизолона ацепоната, который применяется в клинической практике с

1994 года).

* * *

В заключении определим актуальные вопросы молекулярной фармакологии глюкокортикоидов, рационального использования их в практической медицине.

1.Разработка экспериментальных подходов для комплексного изучения негеномных эффектов ГК, взаимоотношений между внутриклеточными и мембранными рецепторами ГК

2.Определение роли каждой из этих систем в преобразовании гормонального сигнала в биохимическую реакцию клетки-мишени.

3. Создание научной основы целенаправленного поиска новых высокоэффективных и безопасных глюкокортикоидных препаратов,

обладающих преимущественно мембранотропным действием.

4. Разработка новых способов диагностики индивидуальной чувствительности больных дерматозами к глюкокортикоидным препаратам, учитывающим мембранный этап в действии ГК.

Данная работа является продолжением научных разработок кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии имени академика П.В. Сергеева.

Впервые в обобщенном виде мембраннорецепторная теория приведена в монографии П.В.Сергеева ―Стероидные гормоны‖ (1984). Используя различные методологические подходы, исследователи убедительно продемонстрировали первоочередную роль плазматической мембраны в

―узнавании‖ стероидов, впервые суммировали экспериментальные свидетельства мембранных участков специфического связывания стероидных гормонов.

Таким образом, результатом первого этапа исследования экстрагеномного пути действия СГ стала идентификация и характеристика специфических участков связывания стероидов на плазматической мембране клеток-мишеней.

Содержанием второго этапа развития данной научной проблемы явилось изучение эффектов стероидов, пусковые механизмы которых локализованы на ПМ, т.н. мембранотропные негеномные эффекты стероидных гормонов.

Значительный вклад в этой области исследований принадлежит коллективам лабораторий, возглавляемых U.Wehling (Германия), E.Baldi (Швейцария), T. Chen (США), B.S. McEwen (Англия) впервые доказавшим экстрагеномный характер действия альдостерона, прогестерона, витамина Д3 и нейростероидов,

соответственно. В мае 1999 г. в Мангейме прошел I Всемирный конгресс с участием фармакологов, биохимиков, клиницистов, посвященный механизмам

развития быстрых (негеномных) эффектов стероидов [Falkenstein et al., 2000].

Следует отметить, что наши исследования негеномных эффектов глюкокортикоидов имеют приоритетный характер.

Целью настоящей диссертационной работы явилось определение фармако-биохимических особенностей действия на фибробласты мономерных глюкортикоидов и наноразмерного кортизол-полимерного комплекса.

В качестве объекта исследования были выбраны фибробласты кожи – клетки-

мишени фармакологического действия глюкокортикоидов, участвующие в воспалительных и аллергических реакциях при дерматозах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В качестве гормональных препаратов использованы: природные гормоны кортизол и кортикостерон, синтетические ГК преднизолон, дексаметазон, а также полимер-

ные производные указанных соединений, иммобилизованные на поливинилпирро-

лидоне м.м. 24 000 Д. В контрольных опытах использовали эстрадиол, тестостерон.

В качестве специфических антагонистов ГК применяли прогестерон, дексаметазон- 21-мезилат, ДОК и препарат мефепристон.

В работе использованы следующие реактивы:

[1,2,6,7,-3Н] Kортизол (80 Ci/ммоль), [1,2,4,6,7-3Н] Преднизолон (75 Ci/ммоль), 3Н-

тимидин (5 Ci/ммоль); МЕСА, фениламиноаденозин, DMPX ("Amersham"); 6-

меркаптопурин ("Jarma"); набор для определения цАМФ и цГМФ производства фирмы “Amersham”; кортизол, преднизолон ("Merck"), гидрокортизон, дексаметазон

(“Sigma”); HEPES, твин-80, среда Хенкса ("Serva"); форболовый эфир, 4-

аминопиридин, актиномицин Д, циклогексимид, трифлуоперазин, t-

бутилгидропероксид ("Sigma"); культуральная среда (MEM Eagle's Medium) ("Sigma"); среда разделения Mono-Poly resolving medium “Flow”;; фура-2/АМ

("Calbiochem"); дигитонин, ЭДТА, АДФ, бычий сывороточный альбумин ("Sigma"); HEPES, PPO, POPOP, аденозин ("Serva"); перколл, фиколл (“Pharmacia Fine Chemicals“); креатинфосфокиназы ("Reanal"),азатиоприн, 2-хлораденозин, 5'-АМФ,

Histopaque-1077, дигитонин, актиномицин D ("Sigma"). Диоксан, толуол, соли, ки-

слоты, щелочи отечественного производства высокой чистоты.

Полимерные производные глюкокортикоидов синтезированы в Институте высокомолекулярных соединений РАН (С.-Петербург). По химической структуре полимерные производные ГК представляют собой водорастворимый тройной сополимер винилпирролидона, малеиновой кислоты и монозамещенного малеата стероида (рис.11).

Средний молекулярный вес сополимеров 20000; содержание гидрокортизона

4,4 мольн% (13,2 масс%), преднизолона 3,8 мольн% (11,5 масс%). Сложноэфирная

связь между макромоле-кулой и стероидом образована ангидридной группой поли-

мера и гидрок-сильной группой при С(21) глюкокортикоида. Удельная радиоак-

тивность для 14С-ПВП-кортизола - 150 ГБк/ммоль, 14С-ПВП-преднизолона - 160

ГБк/ммоль.

где R: гидрокортизон, преднизолон.

гидрокортизон

преднизолон

Рис. 11. Химическое строение полимерных производных глюкокортикоидов.

Химическое строение меченых глюкокортикоидных гормонов, использо-

ванных для изучения связывания с внутриклеточными ГК рецепторами представле-

но на рис.12.

[1,2,6,7 - 3H] Кортизол

[1,2,4,6,7 - 3H] Преднизолон

Рис. 12. Химическое строение меченых тритием аналогов

глюкокортикоидных гормонов.

В качестве объекта исследования использованы фибробласты кожи из биоптатов белых крыс линии Wistar весом 100-200г, взятых из питомника лабораторных животных «Столбовая» РАМН и содержащихся на стандартном рационе вивария в ЦНИЛе. Выведение животных из эксперимента проводили путем передозировки эфирного наркоза с соблюдением всех условий гуманности и в соответствии с

"Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных".

3.1.Фибробласты получали из кожи крыс как описано в работе Lu and Finkel, 2008.

Клетки культивировали в лунках 96-луночного планшета в атмосфере с 5% СО2 при 37оС в среде DMEM, содержащей 10% ЭТС и пенициллин (100ед/мл) со стрептомицином (100 мкг/мл) фирмы “Gibco”. Фибробласты стимулировали добавлением ангиотензина II в концентрации 100 нМ, время инкубации составляло 24 ч. Изучаемые соединения - препараты глюкокортикоидов в дипазоне конечной концентрации (10 нМ -1 мкМ) ПВП-ГК, кортизол, дексаметазон; антагонисты минералкортикоидных рецепторов спиронолактон, рецепторов глюкокортикоидов мифепристон, в конечной концентрации 10 мкМ – добавляли в среду за 1 ч до внесения АII.

3.2. Оценка жизнеспособности фибробластов. Жизнеспособность фибробластов

определяли методом витального окрашивания клеток трипановым синим. В отно-

шении 1:1 суспензию клеток (3 млн в мл) смешивали с 0,2% раствором трипанового

синего (приготовленного на HEPES-буфере) и через 40 секунд под микроскопом

подсчитывали число окрашенных и неокрашенных клеток. Жизнеспособность оце-

нивали в процентах по формуле:

число неокрашенных клеток

---------------------------------------- х 100%

общее число клеток

Для оценки жизнеспособности фибробластов в условиях инкубации их с глю-

кокортикоидными гормонами 1 мл суспензии клеток инкубировали без (контроль)

и в присутствии гормонов (конечная концентрация 1 – 2 мкМ) при 37О С в атмосфе-

ре, содержащей 10% СО2 в течение 4 часов. Через 2 и 4 часа из опытных и кон-

трольных проб отбирали аликвоты суспензии клеток для оценки их жизнеспособно-

сти.

3.3. Определение уровня цитоплазматического рН в фибробластах. Исследования

проводились с помощью флуоресцентного зонда BCECF/AM, который является

внутриклеточным индикатором рН (рис. 10).

Флуоресцентный зонд в виде тетраацетоксиметилового эфира (BCECF/AM) в

силу своей гидрофобности проникает через плазматическую мембрану в цитоплаз-

му, где благодаря высокой активности неспецифических внутриклеточных эстераз,

быстро гидролизуется до тетракислоты, не успевая проникнуть в матрикс митохон-

дрий или во внутривезикулярное пространство ретикулума. В зависимости от вели-

чины рН изменяется конформационное состояние данного зонда, что находит отра-

жение в изменении параметров флуоресценции и позволяет судить о величине внутриклеточного рН.

Нагружение клеток зондом проводили по следующей методике [Патрашев Д.В. и

др., 1999]. К выделенным фибробластам (10-20 млн/мл) добавляли 1 мМ раствор

BCECF/AM в диметилсульфоксиде до конечной концентрации 3 мкМ и инкубиро-

вали 20 мин при 37 С. После этого клетки отмывали и ресуспендировали в HEPES-

буфере.

2 мл суспензии фибробластов (концентрация 3 млн/мл) помещали в ячейку спектрофлуориметра”Hitachi MPF-4”, термостатируемую при 37 С. Спектр возбуж-

дения флуоресценции и спектр флуоресценции регистрировался при 500 и 530 нм соответственно.

Значения уровня рН вычисляли с использованием калибровочных кривых флуоресценции BCECF/AM. Их получали посредством установления равновесия между рНо (значение рН инкубационной среды) и рНi с помощью нигерицина в следующих буферах: MES (6,5-6,8), HEPES (7,1-7,4), Tricine (7,4-8,8).

3.4. Определение внутриклеточной концентрации ионов кальция в фибробластах с помощью флуоресцентного зонда FURA-2.

Зонд FURA-2 относится к семейству флуоресцентных зондов, способных регистрировать концентрацию свободных ионов кальция в клетках [Grynkievich и

др, 1985]. Он содержит 4 карбонильные группы, связывающие ионы кальция коор-

динационными связями по типу EGTA, и хромофорные группы, изменяющие свои свойства при образовании комплексов с ионами Са2+. В виде тетраацетоксимети-

лового эфира, который обозначается как FURA-2/AM, в силу своей гидрофобно-

сти, флуоресцентный индикатор проникает через плазматическую мембрану в ци-

топлазму, где гидролизуется до тетракислоты внутриклеточными эстеразами.

Преимуществом этого зонда является высокое абсолютное значение квантового выхода при существенном влиянии Са2+ на положение максимумов спектра возбу-

ждения флуоресценции. Влияние на спектр флуоресценции при этом незначитель-

но. Химическая строение и спектральные свойства зонда FURA-2/AM приведены на рис. 13 и в таблице 6.

Рис. 13. Химическое строение зонда FURA-2 и его ацетоксиметилового про-

изводного.

Таблица 6. Спектральные характеристики зонда FURA-2.

Нагружение фибробластов флуоресцентным зондом FURA-2. Полученную суспен-

зию клеток (10-15 х 105 кл/мл) инкубировали с FURA-2/AM (конечная концентрация

5 мкМ) при 20 оС в течение 40. Невключившийся индикатор отделяли, дважды от-

мывая клетки свежим Кребс буфером, перед определением флуоресценции тимо-

циты переводили в HEPES-буфер следующего состава (мМ): 145 NaCl, 5 KCl, 1

Na2HPO4, 1 CaCl2, 0.5 MgSO4, 5 глюкоза, 10 NaHEPES, pH 7.4 при 37 oС. Пробы объ-

емом 1 мл помещали в ячейку спектрофлуориметра MPF-4 "Hitachi" и регистри-

ровали флуоресценцию (500 нм) при длинах возбуждающего света 340 нм и 380 нм,

соответствующих максимуму поглощения связанной с ионами и свободной формы зонда FURA-2. Изменение мутности среды, общей концентрации зонда в рабо-

чем объеме и другие факторы, вызывающие пропорциональное изменение состав-

ляющих спектра, не влияют на конечный результат. Для подсчета количества кле-

ток использовали камеру Горяева, жизнеспособность фибробластов оценивали по

исключению трипанового синего (85-90 % жизнеспособных клеток на начало экс-

периментов).

Расчет концентрации ионов Са2+ в цитоплазме клеток.

Внутриклеточную концентрацию кальция рассчитывали на основании измерений при двух длинах волн возбуждения (F340 и F380), используя следующий прием. В

где cf и cb - концентрации свободного индикатора и его комплекса с кальцием со-

ответственно, а S - фактор, зависящий от коэффициента поглощения, интенсивности возбуждающего света, длины оптического пути в кювете, квантового выхода. Вводя параметр R = F340/F380 и применив уравнение закона действующих масс для реак-

ций первого порядка cb = cf * [Сa++]цит /Kd можно перейти к выражению:

(Sf340 + Sb340 * [Сa2+]цит /Kd) * (Sf380 + Sb380 * [Сa2+]цит /Kd) = R и, решая его

относительно R, получаем