диссертации / 5

60

следующими уравнениями: у = 0,463 –0,17х для дексаметазона; у = 0,37 –

0,12х для преднизолона; у = 0,19 – 0,07х для кортизола.

Рис. 18. Специфическое связывание 3Н-кортизола (1) и 3Н-преднизолона

(2) фибробластами, представленное в координатах Скэтчарда.

По оси абсцисс - концентрация связанного лиганда, пмоль/106 клеток.

По оси ординат - отношение количества связанного и свободного гормона, пмоль/нМ 106 клеток.

Величина В/F для 3Н -дексаметазона почти в два раза выше, чем у 3Н -

кортизола, что свидетельствует о преимущественном связывании дексаметазона внутриклеточными рецепторами ГК клеток. Преднизолон занимает промежуточное положение.

В табл. 6 приведены параметры специфического связывания (Кд -

равновесная константа диссоциации, Вмакс - концентрация связывающих участков) дексаметазона, кортизола и преднизолона внутриклеточными и мембранными рецепторами ГК фибробластов. При расчете количества мест связывания на клетку взята средняя величина. Обращает внимание, что внутриклеточные рецепторы ГК отличаются высоким аффинитетом (Кд не превышает 18 нМ) и относительно небольшой связывающей емкостью (0.27-

0.36 пмоль/кг белка или в среднем 6х103 участков связывания на клетку). В

зависимости от степени сродства к рецепторам ГК располагаются в ряду:

61

дексаметазон дексаметазон-21-мезилат > преднизолон > кортизол >

прогестерон > 11-ДОК >> тестостерон > эстрадиол. Полученные результаты согласуются с литературными данными [ Raneletti F.O. et al., 1987, Голиков

П.П. и соавт., 1992 ].

Для мембранных «систем узнавания» ГК характерны более высокая концентрация мест связывания (3-4,3 пмоль/мг белка, 75х103 /клетку) и

менее выраженная аффинность (Кд порядка 0.3 мкМ). Тропность ГК к мембранной рецепторной системе подчиняется следующей закономерности:

кортизол > преднизолон > дексаметазон.

Таким образом, взаимодействие различных ГК с внутриклеточной и мембранной рецепторными системами клеток имеет характерные особенности.

Синтетические препараты дексаметазон и преднизолон в изученном диапазоне концентраций (2-30 нМ) избирательно связываются внутриклеточными рецепторами ГК. Отношение Кдмем /Кдвн , отражающее характер распределения ГК между внутриклеточными и мембранными рецепторами, для дексаметазона

и преднизолона равно соответственно 66,6 и 40,8. В то же время Кдмем /Кдвн,

вычисленное для кортизола, составляет 10.3, что свидетельствует о

преимущественном связывании природного гормона плазматической мембраной фибробластов.

Проведено сравнительное изучение основных характеристик мембранных и внутриклеточных участков связывания ГК, определены

различным стероидам. Установлено, что мембранные и внутриклеточные участки связывания различаются как аффинностью к гормонам, так и концентрацией мест связывания. Внутриклеточные рецепторы ГК характеризуются более высоким сродством (Кд порядка 10 нМ) и

значительно меньшим числом связывающих участков (примерно в 20 раз).

Отличаются эти две рецепторные системы и по способности связывать ГК

62

гормоны и синтетические стероиды. Для синтетических глюкокортикоидов дексаметазона и преднизолона характерна избирательность связывания с цитозольными рецепторами ГК. Тропность природных глюкокортикоидов кортизола и кортикостерона к внутриклеточным рецепторам проявляется в значительно меньшей степени.

Глава 4.2. Определение молекулярных мишеней апоптотического действия глюкокортикоидов на фибробласты кожи.

Апоптотическая реакция лежит в основе фармакологического действия глюкокортикоидов при лечении многих аллергических, в том числе кожных заболеваний, в патогенезе которых принимают участие фибробласты. При этом возможны как желательные иммунодепрессивные эффекты гормональной терапии (апоптоз имунокомпетентных Т-лимфоцитов), так и нежелательное атрофическое влияние стероидов на кожу (апоптоз фибробластов).

I. Важным интегральным показателем клеточного гомеостаза является внутриклеточный рН (рНi). Постоянство рНi в покоящихся клетках определяется буферными свойствами внутриклеточных компонентов: белков,

нуклеотидов, неорганических фосфатов и карбонатов. Активным компонентом Н+-обмена служит Na/H-переносчик, локализованный в плазматической мембране, осуществляющий обмен внеклеточного иона натрия на

внутриклеточный протон. Движущей силой переноса является электрохимический градиент Na+ (потенциал покоя ПМ фибробластов

глюкокортикоидов на величину внутриклеточного рН с помощью флуоресцентного зонда BCECF; сравнение закономерностей изменения внутриклеточного рН при апоптотической и некротической формах гибели фибробластов.

Величина рНвн в контрольных образцах клеток, в отсутствие химического воздействия (контроль 1), составляла 7,12 0,05 (n=6) и незначительно

63

изменялась в течение всего времени наблюдения. Через 1,5 ч рНвн в

контрольных пробах приближалось к величине 7,03 0,05 (n=3).

В начальный момент времени значение рНвн в клетках, подвергшихся воздействию БГП, равнялось 7,09 0,06 (n=4), достоверно не отличаясь от контрольных. По мере увеличения времени инкубации с БГП величина рНвн

плавно повышалась, выходя на плато к 60-75 мин наблюдения. При этом конечное значение рНвн составляло 7,35 0,04 (n=4), примерно соответствующее величине рН инкубационной среды (рНвнеш). По-видимому, происходило выравнивание рНвн во внеклеточном и внутриклеточном пространствах. Для проверки этого предположения была использована инкубационная среда с заданным значением рНвнеш, равным 7,5. В новых условиях эксперимента динамика изменений рНвн в целом имела сходный характер (рис. 19), однако,

конечные значения рНвн уже составляли 7,51 0,07 (n=3). Следует отметить, что значения рНвн в контрольных образцах фибробластов (контроль 2),

инкубировавшихся в среде с рНвнеш=7,5, колебались в пределах 7,02– 7,16,

достоверно не отличаясь от уровня рНвн в контроле 1.

64

Таким образом, при некротической форме гибели клеток наблюдаются нарушения гомеостатической функции плазматической мембраны,

выражающиеся в выравнивании рНвн и рНвнеш к 60-й мин после начала воздействия БГП. Маловероятно, что повышение рНвн связано с активацией

Na/H-обмена, так как добавление в суспензию клеток селективного ингибитора антипорта препарата амилорида не влияло на динамику изменения рНвн.

Внесение в среду инкубации, наряду с БГП, ингибитора синтеза АТФ 2-

дезоксиглюкозы (30 мМ) и блокатора киназных реакций трифлуоперазина

(ТФП, 50 мкМ) только усугубляло нарушения клеточного гомеостаза, приводя к выравниванию рНвн и рНвнеш к 45-ой мин инкубации (рис. 19, кривая 3).

Апоптотическую форму гибели фибробластов индуцировали дексаметазоном (1 мкМ). Инкубация клеток с дексаметазоном приводила к закислению внутриклеточной среды, достоверные изменения рНвн

регистрировали, начиная с 45-ой мин инкубации (рНвн = 6,95 0,04; n=4). В

последующий отрезок времени величина рНвн плавно уменьшалось, достигая значений 6,87 0,04 к концу наблюдения (рис. 20). Предварительное внесение в среду инкубации 2-дезоксиглюкозы и ТФП отменяло изменения рНвн,

индуцированные дексаметазоном. Полученные данные указывают на участие в рН-ответе фибробластов энергетически-зависимых реакций.

Для изучения молекулярных механизмов действия дексаметазона на Na/H-

обмен были использованы 3 экспериментальных подхода, включающие оценку влияния глюкокортикоида на активацию Na/H-обмена в фибробластах с помощью ангиотензина II (100 нМ, АII), активатора фосфоинозитидного обмена форболмеристатацетата (20 нМ, ФМА) и осмотическую стимуляцию.

Вне зависимости от природы воздействия, изменение рНвн наступало быстро (в пределах 5-10 мин), блокировалось амилоридом (200 мкМ),

внутриклеточная среда защелачивалась, диапазон значений рНвн составлял от

7,28 до 7,32. Дексаметазон (1 мкМ) достоверно ингибировал подъем рНвн на всех экспериментальных моделях; предварительная инкубация с дексаметазоном не требовалась, достаточно было внести глюкокортикоид за 3-5

мин до воздействия AII, ФМА или гиперосмотического шока. Полученные данные суммированы в таблице 8.

66

Таблица 8. Влияние различных экспериментальных условий на рНвн фибробластов

Условия: дексаметазон добавляли в инкубационную среду за 3–5 мин до внесения изучаемых препаратов (ФМА, ангиотензин II, амилорид). Отсчет времени в таблице указан с момента введения изучаемых препаратов. Обозначения: ФМА – форболмеристатацетат. *– достоверное отличие (p <0,05) от контрольных значений; ** – достоверное отличие (p <0,05) по отношению к действию ангиотензина II; *** – достоверное отличие (p <0,05) по отношению к действию ФМА.

Достоверное увеличение рНвн наблюдали, начиная с 45-й минуты инкубации с ангиотензином II (100 нМ) или ФМА (20 нМ). Подъем рНвн,

вызванный ангиотензином II или ФМА, блокировался амилоридом (200 мкМ):

внутриклеточная среда защелачивалась, диапазон значений рНвн составлял от

7,28 до 7,32. Дексаметазон (1 мкМ) ингибировал подъем рНвн на всех экспериментальных моделях (таблица).

Таким образом, ингибирующее действие дексаметазона на Na/H-обмен в фибробластах может быть отнесено к ранним, негеномным эффектам глюкокортикоидов, а ингибирование Na/H-обмена – к ранним проявлениям апоптотического пути гибели клеток, индуцированных дексаметазоном.

II. В задачи второй части исследования входило исследование динамики апоптотического изменения концентрации ионов Са2+ в цитоплазме фибробластов с помощью флуоресцентного индикатора FURA-2.

68

мкМ) в суспензию клеток вносили блокатор синтеза РНК актиномицин Д (1

мкМ) или ингибитор трансляции циклогексемид (30 мкМ). Указанные соединения достоверно изменяли динамику Са-ответа фибробластов на дексаметазон: отсутствовал резкий подъем уровня [Ca++]цит после 120 мин инкубации с дексаметазоном. Однако тот факт, что ответ не отменялся полностью, свидетельствует о вкладе как геномных, так и негеномных механизмов глюкокортикоидного эффекта.

Таким образом, с помощью флуоресцентного зонда FURA-2 определен уровень

[Ca2+]цит в суспензии фибробластов на начальных этапах дексаметазон-

иидуцированного апоптоза, выяснен вклад геномных и негеномных механизмов действия ГК в изменение кальциевого гомеостаза. Базальный уровень [Ca2+]цит в

фибробластах составляет 105 12 нМ. Влияние дексаметазона (0,1-10 мкМ) на уровень [Ca2+]цит в фибробластах характеризуется дозовой и временной зависимостью. Выявлены две фазы кальциевого ответа на ГК. Первая фаза характеризуется плавным нарастанием, начиная с 60 мин, внутриклеточного содержания Са2+. Во второй фазе (после 120 мин инкубации) отмечается максимальное увеличение концентрации цитозольного Са2+ (187 13 нМ или

78 6% от начальной величины). Одновременное с дексаметазоном внесение блокатора синтеза РНК актиномицина Д (1 мкМ) и ингибитора процесса трансляции циклогексемида (30 мкМ) достоверно изменяло ответ фибробластов, однако не отменяло его полностью. Можно предположить, что увеличение [Ca2+]цит связано с изменением проницаемости мембраны для ионов

Ca2+, а не с мобилизацией их из внутриклеточных депо. Увеличение [Ca2+]цит

является результатом как геномных, так и негеномных механизмов глюкокортикоидного эффекта.

Таким образом, на экспериментальной модели окислительного стресса установлено, что некротический путь лизиса фибробластов характеризуется ранними нарушениями механизмов поддержания рНвн, значения которого выравнивается с рН внеклеточной среды после 60-й минуты инкубации с БГП.

69

На экспериментальной модели апоптоза показано, что через 1 ч после

воздействия дексаметазона наблюдается достоверное закисление внутриклеточной среды (рНвн =6,87 0,04). К одному из молекулярных механизмов рН-ответа фибробластов относится ингибирование активности

Na/H-обмена.

Глава 4.3. Использование наноразмерного кортизол-полимерного комплекса

для изучения механизмов регуляции функциональной активности

фибробластов кожи

4.3.1. Изучаемые геномные механизмы регуляции функциональной активности фибробластов включали: 1) влияние глюкокортикоидов на базальную и стимулированную ангиотензином II (AII) клеточную пролиферацию; 2) влияние глюкокортикоидов на базальный и индуцированный синтез коллагена,

оцениваемый по включению меченного тритием пролина.

АII достоверно увеличивает инкорпорацию меченых предшественников:

включение тимидина в среднем на 57%, пролина – на 31%. Пролиферативный эффект ангиотензина II (100 нМ) и его влияние на синтез коллагена в фибробластах опосредовано АТ1-типом мембранных рецепторов [11], действие АII отменяется конкурентным антагонистом АТ1-рецепторов ирбесартаном (1

мкМ).

ГК во всем изученном диапазоне концентраций (1нМ – 10 мкМ)

ингибировали включение [3H]-тимидина в ДНК фибробластов. В концентрации ГК выше 10 нМ наблюдается достоверное снижение стимулированнго АII

синтеза ДНК; начиная с концентрации 1 мкМ ГК подавляют и базальный уровень включения меченого тимидина (рис. 22А). Влияние ГК на синтез коллагена определяется в основном подавлением индуцированного АII уровня,

базальный уровень включения меченого пролина снижается не более, чем 10-

15%. Сравнение активности глюкокортикоидов свидетельствует о 4-5-кратном