Микроскопические методы исследования в клинической лабораторной диагностике заболеваний урогенитального тракта. Общие принципы Методические рекомендации
.pdfнеотчетливо. Каждое следующее увеличение подтверждает или опровергает предположение, возникшее при использовании предыдущего увеличения. Это позволяет перейти от предположения к заключению.
7.1. Проведение микроскопического исследования
Последовательность микроскопического анализа может быть избрана самим исследователем.
1.Для исследования влажного препарата нужно поместить предметное стекло на столик микроскопа покровным стеклом вверх. Движением ирисовой диафрагмы конденсора необходимо выбрать положение, позволяющее получить контрастное изображение препарата. Если конденсор не оснащен диафрагмой, подобного эффекта можно достичь опусканием конденсора. После завершения микроскопии влажного препарата диафрагму надо открыть.
2.Микроскопию следует начинать с объектива наименьшего увеличения. Ошибка начинающих – приступать к микроскопическому исследованию с большого увеличения или пользоваться малым и средним увеличением лишь в течение короткого времени, что приводит к потере важной информации. Влажный влагалищный препарат покрывает большую поверхность предметного стекла по сравнению с уретральным или цервикальным препаратами, так что удобно начинать с микроскопии влажного влагалищного препарата, применяя малое увеличение (объектив х4). Если микроскоп не имеет этого объектива, нужно применить объектив х10. Уретральный и цервикальный влажные препараты занимают обычно меньшую поверхность стекла, поэтому можно начинать их микроскопию с объектива х10.
3.Под контролем глаза устанавливают наименьшее расстояние между предметным стеклом и объективом с помощью макрометрического винта. Затем, глядя в окуляр микроскопа, вращают этот винт в обратном направлении, наблюдают за появлением изображения и настраивают до получения четкого изображения.
4.Последовательный просмотр всего влажного препарата проводят с применением объектива х4. При отсутствии скоплений и равномерном распределении всех микроскопических объектов можно перейти к следующему увеличению микроскопа путем смены объектива. При большой плотности препарата следует подвинуть край скопления к центру поля зрения и затем изменить увеличение. Этот участок будет виден более отчетливо. При этом надо помнить, что более высокое увеличение сокращает поле зрения по сравнению с предыдущим и увеличивает видимость центральной части препарата.
5.При смене объективов во время просмотра окрашенных препаратов удобно изменять силу света. Маломощный объектив имеет большую апертуру, поэтому достаточно подавать меньше света, и, наоборот, для получения изображения высокомощным объективом требуется больше света.
6.Применяя объектив х10, следует изучить, по крайней мере, 10 полей зрения. При этом увеличении можно идентифицировать клетки эпителия и полиморфноядерные лейкоциты.
20
7.Весь клинический материал из одной анатомической области должен вначале рассматриваться при малом увеличении.
8.При замене объектива нет необходимости пользоваться макрометрическим винтом.
9.Помните, что применение иммерсионного масла необходимо только для объективов х90 или х100. При переходе от масляной иммерсии к более низкому увеличению необходимо опустить предметный столик для предохранения других объективов от загрязнения маслом.
7.1.1. Микроскопическое исследование нативных препаратов при малом увеличении
Микроскопическое исследование влажного препарата проводят вначале при закрытой диафрагме конденсора. Последовательно изучают образец, пользуясь объективом х10, а если микроскоп имеет объектив х4, то выгодно начать просмотр с этого увеличения. Устанавливают расстояние между препаратом и объективом, силу света для получения четкого изображения. Находят участки, где клинический материал распределился равномерно, образуя тонкий слой. При этом увеличении обычно можно видеть клетки плоского эпителия, скопления слизи, псевдомицелий. Следует выбрать поля зрения, которые необходимо изучить при большем увеличении.
7.1.2. Микроскопия нативных препаратов при большом увеличении
Применяя объектив х40 при изучении нативного препарата, можно сделать окончательные выводы. При этом увеличении видны мелкие палочки и\или кокки, которые являются представителями вагинальной микрофлоры. Они могут выглядеть подвижными во «влажном» препарате, но это не их собственная подвижность. Иллюзия подвижности бактерий возникает из-за хаотически движущихся молекул воды, которые сталкиваются с микроорганизмами (броуновское движение). Микроорганизмы при этом колеблются с малой амплитудой, медленно и монотонно. Пользуясь микрометрическим винтом, можно при этом увеличении увидеть клетки, не являющихся эпителиальными. Большинство из них имеют полисегментированные ядра, что дает основание идентифицировать их как полиморфноядерные лейкоциты. Другие безъядерные клетки, которые могут быть видны – это эритроциты. Настраивая фокус микрометрическим винтом, можно увидеть углубление в центре такой клетки и отсутствие ядра. При гемолизе эритроциты приобретают неровный контур.
7.1.3. Микроскопическое исследование окрашенных препаратов
Материал из уретры, влагалища и цервикального канала берется на два предметные стекла. Одно стекло предназначается для окраски по Граму, второе – для окрашивания метиленовым синим.
21
Клинические образцы из гениталий мужчин и женщин имеют разное значение. У женщин воспалительный процесс влагалища и/или цервикального канала сопровождается обильными выделениями, часто контаминирующими уретральный материал (клетки плоского эпителия, лейкоциты, вагинальная микрофлора). Такой материал уретры не пригоден для дальнейшей оценки, т.к. он не отражает состояния слизистой уретры. Если во влагалище нет острого воспалительного процесса, то можно получить репрезентативный материал из уретры, не содержащий или содержащий мало вагинального эпителия и микрофлоры.
У мужчин клинический материал, полученный из уретры, объективно отражает процесс, протекающий в уретре. Для получения качественного образца пациенту следует воздержаться от мочеиспускания в течение 3–4 часов.
Прямая микроскопия материала из уретры, окрашенного метиленовым синим проводится с открытой диафрагмой конденсора. Можно начать микроскопию с объектива х10, настроив расстояние между препаратом и объективом, силу света для получения четкого изображения. Для оценки качества образца и выявления участков, пригодных для дальнейшей оценки, нужно исследовать весь препарат. Следует найти участки, где эпителий уретры расположен монослоем. Мелкие клетки, имеющие сегментированные ядра, должны присутствовать не только среди клеток эпителия, но также и в слизи. Даже при малом увеличении заметно, что некоторые из этих клеток являются лейкоцитами или эритроцитами.
Следующий этап – это поиск репрезентативного поля зрения для более подробного изучения. Если ни одного лейкоцита в образце не найдено, это означает, что на момент взятия нет микроскопических признаков воспаления. Выявленные участки, где предположительно видны лейкоциты, должны быть исследованы более тщательно. Очень важно выявить лейкоциты между клетками эпителия и в слизи.
Наиболее информативными участками препарата, отражающими процесс, происходящий в уретре, являются такие, в которых среди тонкого слоя эпителиальных клеток находится наибольшее количество лейкоцитов. При остром уретрите лейкоциты равномерно покрывают все поля зрения, а при хроническом они располагаются небольшими скоплениями в слизи.
При использовании объектива х100 с иммерсией подсчет лейкоцитов следует проводить, по меньшей мере, в пяти полях зрения. Особое внимание следует обратить на поиск диплококков, расположенных внутриклеточно в лейкоцитах.
Методические подходы к микроскопической оценке клинического материала влагалища одинаковы как при исследовании мазков, окрашенных метиленовым синим, так и мазков, окрашенных по Граму. При необходимости уточнения этиологического фактора исследования могут быть использованы другие методы лабораторной диагностики (культуральные, молекулярно-биологические и прочие).
22
Глава 8. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
При проведении процедуры окрашивания препаратов для микроскопического исследования каждая партия мазков должна содержать контрольные стекла с заведомо грамположительными и грамотрицательными бактериями.
Источники ошибок:
1.Неудовлетворительное техническое состояние микроскопа затрудняет оценку результата
2.Неправильное и неадекватное взятие клинического материала может привести к невозможности точной интерпретации результата
3.Надписи маркером, не предназначенным для стекол, в процессе фиксации
иокрашивания могут исчезнуть с поверхности и загрязнить препарат
4.Неправильное нанесение материала на стекло (необходимо прокатывать тампон по стеклу) приводит к повреждению клеток, вследствие чего может быть нарушена их морфология
5.Недостаточная фиксация в пламени горелки может привести к удалению материала со стекла во время окраски
6.Перегрев во время фиксации может привести к повреждению клеток и окраске возникших артефактов
7.Не рекомендуется использование раствора Люголя после 90 дней при хранении его при комнатной температуре
8.При переобесцвечивании мазка грамположительные микроорганизмы могут окраситься как грамотрицательные
9.При недообесцвечивании мазка грамотрицательные микроорганизмы могут окраситься как грамположительные
10.Реактивы, загрязненные другими микроорганизмами, могут давать ошибочные результаты.
Внимание! На всех этапах выполнения микроскопического исследования необходимо строго соблюдать правила безопасности для персонала.
Глава 9. БЕЗОПАСНОСТЬ ПЕРСОНАЛА
Со всеми тестируемыми образцами, а также оборудованием и материалами, находящимися с ними в контакте, следует обращаться как с потенциально зараженными объектами:
1.Работать в лабораторной одежде и медицинских перчатках
2.При попадании исследуемого материала на кожу и слизистые, немедленно промыть водой с мылом и обработать антисептиком
3.Все твердые отходы замачивать в 3% растворе перекиси водорода в течение 3-х часов или специальных готовых дезинфицирующих растворах с рекомендованной производителем экспозицией
4.Инструменты и оборудование до и после работы протирать 70% спиртом.
23
Литература
1. Вагорас А., Савичева А., Галлен А., Домейка М. Основы микроскопии мазков мочеполового тракта.-Каунас:Издательство студия «КАТА», 2001. 42 с.
2.Данилова Л.А. и др. Справочник по лабораторным методам исследования. М., 2003.
3.Дмитриев Г.А. Лабораторная диагностика бактериальных урогенитальных инфекций. – Москва: Медицинская книга, Н.Новгород: Издательство НГМА, 2003. 336 с.
4.Егорова О.В. С микроскопом на «ты». – СПб.: Интермедика, 2000. 328 с.
5.Медицинские лабораторные технологии. Справочник в 2-х томах под ред.А. И. Карпищенко, Санкт-Петербург, Интермедика, 2002.
6.Порядок проведения микроскопического исследования мазков из урогенитального тракта. Методические рекомендации для специалистов по лабораторной диагностике / А.М. Савичева, Е.В. Соколовский, М. Домейка. – Санкт-Петербург: Издательство Н-Л,
2007. – 64 с.
7.Порядок проведения микроскопического исследования мазков из урогенитального тракта. Методические рекомендации для лечащих врачей / А.М. Савичева, Е.В. Соколовский, М. Домейка. – Санкт-Петербург: Издательство Н-Л, 2007. – 60 с.
8.Савичева А.М., Соколовский Е.В., Домейка М. Краткое руководство по микроскопической диагностике инфекций, передаваемых половым путем. – СПб: ООО «Издательство Фолиант», 2004. – 128 с.
9.Соколовский Е.В., Савичева А.М., Домейка М., Айламазян Э.К., Беляева Т.В. Инфекции, передаваемые половым путем. Руководство для врачей/ М., Медпресс-Информ, 2006, 256 с.
10.Laboratory diagnosis of sexually transmitted diseases/E. Van Dick, A.Z. Meheus, P.Piot. WHO, 1999. 135 p.
11.Laboratory methods for the diagnosis of sexually transmitted diseases/Ed. by B.B.Wentworth, F.N.Judson, M.J.R.Gilchrist. APHA, St.Mary’s Press, USA, 1991. 340p.
12.Microscopy for STIs/Ed. by C.A.Ison, M.Savage, D.Taylor-Robinson. Yale Press Ltd., London, UK, 2001. 36 p.
Учебное издание
Спасибова Елена Владимировна, Шалепо Кира Валентиновна, Будиловская Ольга Викторовна, Хуснутдинова Татьяна Алексеевна, Крысанова Анна Александровна, Шипицына Елена Васильевна, Воробьев Сергей Владимирович, Савичева Алевтина Михайловна
Микроскопические методы исследования в клинической лабораторной диагностике заболеваний урогенитального тракта. Общие принципы
Методические рекомендации
Подписано в печать 28.03.2018 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Таймс. Объем 1,5 печ. л. Тираж 100 экз. Заказ № 22.
Отпечатано в ЦМТ СПбГПМУ
ISBN 978-5-907065-14-7
24
Коллектив авторов:
Спасибова Елена Владимировна – ассистент кафедры клинической лабораторной диагностики ФП и ДПО ФГБОУ ВО СПБГПМУ МИНЗДРАВА РОССИИ, врач-бактериолог лаборатории микробиологии ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О.Отта»
Шалепо Кира Валентиновна – к.б.н., доцент кафедры клинической лабораторной диагностики ФП и ДПО ФГБОУ ВО СПБГПМУ МИНЗДРАВА РОССИИ, старший научный сотрудник лаборатории микробиологии ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О.Отта»
Будиловская Ольга Викторовна – ассистент кафедры клинической лабораторной диагностики ФП и ДПО ФГБОУ ВО СПБГПМУ МИНЗДРАВА РОССИИ, научный сотрудник лаборатории микробиологии ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О.Отта»
Хуснутдинова Татьяна Алексеевна – ассистент кафедры клинической лабораторной диагностики ФП и ДПО ФГБОУ ВО СПБГПМУ МИНЗДРАВА РОССИИ, научный сотрудник лаборатории микробиологии ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О.Отта»
Крысанова Анна Александровна – ассистент кафедры клинической лабораторной диагностики ФП и ДПО ФГБОУ ВО СПБГПМУ МИНЗДРАВА РОССИИ, научный сотрудник лаборатории микробиологии ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О.Отта»
Шипицына Елена Васильевна – д.б.н., профессор кафедры клинической лабораторной диагностики ФП и ДПО ФГБОУ ВО СПБГПМУ МИНЗДРАВА РОССИИ, ведущий научный сотрудник лаборатории микробиологии ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О.Отта»
Воробьев Сергей Владимирович – д.м.н., профессор кафедры клинической лабораторной диагностики ФП и ДПО ФГБОУ ВО СПБГПМУ МИНЗДРАВА РОССИИ
Савичева Алевтина Михайловна – заслуженный деятель науки РФ, д.м.н., профессор, заведующая кафедрой клинической лабораторной диагностики ФП и ДПО ФГБОУ ВО СПБГПМУ МИНЗДРАВА РОССИИ, заведующая лабораторией микробиологии ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О.Отта»
25