Микроскопические методы исследования в клинической лабораторной диагностике заболеваний урогенитального тракта. Общие принципы Методические рекомендации
.pdf10. Установите окуляр и приступайте к наблюдениям.
В идеале, настройка производится для каждого объектива и индивидуально каждым пользователем.
1.4.Хранение и уход
1.Микроскоп должен храниться выключенным и накрытым чехлом.
2.Перед началом работы следует убедиться, что все объективы чистые и расстояние между окулярами соответствует расстоянию между глаз исследователя.
3.Для очистки оптических частей микроскопа не используйте грубых материалов, лучше применять специальные салфетки для оптики.
4.Остатки иммерсионного масла следует удалять после каждой микроскопии с помощью пропитанного 90% этиловым спиртом ватного тампона, накрученного на заостренную деревянную палочку. Все наружные поверхности объективов и окуляров аккуратно и без надавливания протираются с помощью деревянной палочки с острым концом, обернутым ватой и слегка смоченным спиртом.
5.Все внутренние части очищаются от пыли сдуванием с помощью резиновой груши.
6.Ни в коем случае нельзя дотрагиваться до поверхности внутренних линз или разбирать объектив!!!
Малый набор для ухода за микроскопом должен содержать следующие предметы:
1.Вата не техническая (хлопковая медицинская).
2.Деревянная палочка с заостренными концами.
3.Этиловый спирт 90%.
4.Резиновая груша небольшая.
5.Салфетка для оптики.
Глава 2. ВОЗМОЖНЫЕ ПРОБЛЕМЫ
МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ РЕШЕНИЕ
1.При проведении микроскопии нативного (влажного) мазка во время установки расстояния между объективом и предметным стеклом изображение не появляется – диафрагма конденсора не закрыта.
2.Появление кристаллов во влажном препарате говорит о том, что препарат стал слишком сухим. Чтобы сохранять его на более длительное время, нужно пользоваться влажной камерой (чашка Петри с кусочком влажной фильтровальной бумаги на дне).
3.Изображение препарата, зафиксированного над пламенем горелки и окрашенного метиленовым синим, не имеет резкости – чрезмерное нагревание разрушило клетки.
10
4. Слишком резкие очертания клеток и слишком мало света при настройке максимального освещения – диафрагма конденсора закрыта.
5.Объект нечеткий и не удается его сфокусировать:
-предметное стекло перевернуто мазком вниз
-на препарате осталось высохшее иммерсионное масло после предыдущего исследования
-иммерсионное масло нанесено на влажное предметное стекло
-мазок приготовлен неправильно – слишком толстый
-иммерсионное масло могло попасть на линзу конденсора
-иммерсионное масло могло попасть на линзу объектива
-грязное покровное стекло
-толстое покровное стекло
6. Появляются движущиеся пузыри, что мешает фокусированию:
- при микроскопии используются разные порции иммерсионного масла - иммерсионное масло нанесено на влажное предметное стекло - воздушные пузырьки в иммерсионном масле 7. Неравномерное освещение (яркая часть с одной стороны):
-конденсор не отцентрован
-объективы не зафиксированы в правильном положении 8. Слишком яркое изображение:
-необходимо уменьшить яркость освещения реостатом осветителя или фильтром; не следует использовать для этого диафрагму
9.Наличие посторонних частиц:
-пыль на окуляре, объективе, предметном стекле или конденсоре. Необходимо подвигать окуляры или конденсор. Если частицы двигаются, очистите окуляр или конденсор.
Глава 3.
ЛАБОРАТОРНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ
3.1.Инструменты, приборы и оборудование
1.Световой микроскоп, окуляры х4, х7, х10, объективы х10, х20, х40, х100, темнопольный и фазовоконтрастный конденсоры.
2.Люминесцентный микроскоп, объективы х10, х40, х100.
3.Влажная камера.
3.2.Материалы
1.Бактериологические петли объемом 1 и 10 мкл для взятия материала
2.Зонды-пробоотборники или специальные щеточки для взятия материала
3.Ватные или дакроновые тампоны для взятия материала
4.Ватные тампоны для удаления слизи
5.Зеркала гинекологические
11
6.Специальные предметные стекла
7.Пипетки на 30 мкл
8.Стеклянная емкость на 200 мл
9.Покровные стекла 24x24
10.Иммерсионное масло
11.Спирт медицинский
12.Физиологический раствор
13.Набор красителей
14.Фильтровальная бумага
15.Таймер
16.Спиртовка
17.Перчатки резиновые медицинские
18.Дезинфицирующие растворы
3.3. Реактивы для окрашивания
Реактивы для окрашивания метиленовым синим
1.1% раствор метиленового синего (1 г метиленового синего растворяют в 100 мл холодной дистиллированной воды, фильтруют через бумажный фильтр).
2.96% этиловый спирт.
Реактивы для окрашивания метиленовым синим по Леффлеру
1.Насыщенный спиртовой раствор метиленового синего – 30 мл.
2.Вода дистиллированная – 100 мл.
3.1% водный раствор КОН – 1 мл.
Реактивы для окрашивания по методу Грама
1.Карболовый раствор кристаллического фиолетового. Растирают в ступке 1 г кристаллического фиолетового с 2 г фенола (карболовой кислоты) до кашицеобразной консистенции, прибавляют небольшими порциями 10 мл 96% спирта, окончательно разводят добавлением 100 мл дистиллированной воды, сливают во флаконы, оставляют на сутки, затем фильтруют.
2.Раствор Люголя: йодистого калия 2 г растворяют в 300 мл дистиллированной воды, в полученном растворе растворяют 1 г кристаллического йода, фильтруют через бумажный фильтр.
3.Разведенный фуксин Циля. Растирают в ступке 1 г фуксина, прибавляют, растирая, 5 г фенола (карболовой кислоты) и 10 мл спирта 96%, затем при постоянном помешивании небольшими порциями доливают 100 мл дистиллированной воды. Раствор краски фильтруют через влажный бумажный фильтр. Фуксин Циля очень стойкий и может храниться долгое время во флаконе темного стекла с притертой пробкой. К 1 мл фуксина Циля добавляют 9 мл дистиллированной воды. Раствор очень нестойкий, поэтому его готовят непосредственно перед употреблением в необходимых количествах.
12
Глава 4.
ПОЛУЧЕНИЕ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ
Приготовление препарата для микроскопического исследования – это нанесение на предметное стекло клинического материала с поверхности слизистой оболочки гениталий, а при необходимости из экстрагенитальных локусов. В некоторых случаях материалом для микроскопического исследования служит соскоб, состоящий не только из выделений, но и части клеток слизистой, и более глубоких слоев. Микроскопическое исследование включает не только описание эпителия, микроорганизмов и других морфологических объектов, но и оценку их количества и соотношения. Информативность микроскопического исследования зависит от физиологического состояния пациента на момент взятия образца. Наиболее показателен клинический материал, собранный при следующих условиях:
1.Клинические образцы получены при наличии симптомов заболевания
2.Пациент не использовал местного лечения в течение последних 48–72 ча-
сов
3.При отсутствии явных клинических проявлений взятие материала из гениталий женщин желательно производить в середине менструального цикла
4.У мужчин получение образцов из уретры необходимо проводить в течение 3–4 часов после от мочеиспускания
5.Пациент не должен принимать душ в течение 24 часов до взятия образ-
цов.
Несоблюдение этих условий может значительно повлиять на качество клинического материала и исказить интерпретацию результатов. Системная терапия антибактериальными препаратами также может снизить диагностическую ценность микроскопического исследования.
Важно соблюдать последовательность взятия материалов от одного пациента для различных методов диагностики.
Нужно учитывать, что:
1.Материал из уретры для микроскопического исследования берут раньше других уретральных образцов или сразу же после взятия выделений или соскобов для культурального исследования на гонококки.
2.Клинический материал для приготовления нативного (влажного) препарата из влагалища берут раньше других вагинальных образцов. Участок влагалища, с которого предстоит взять образец, выбирают, учитывая клиническую ситуацию. Обильные выделения и подозрение на трихомонадную или кандидозную инфекцию диктуют взятие материала из заднего свода влагалища, поскольку там концентрация предполагаемого возбудителя инфекции наибольшая. При нормальном количестве выделений образец следует брать с боковой стенки влагалища, т.к. этот материал более надежен для получения информации о состоянии микробиоценоза на данный момент.
3.Точно так же образец из цервикального канала шейки матки для микроскопического исследования берут раньше других цервикальных образцов или
13
непосредственно после взятия образца для культуральной диагностики гонореи.
4.Предметные стекла должны быть достаточно тонкими (стандартными), сухими, чистыми, не поцарапанными (оптимально применять новое стекло для каждого нового образца).
5.Взятый клинический образец наносится тонким слоем на одну сторону предметного стекла так, чтобы получить тонкий мазок. При желании можно поместить материал из нескольких мест, взятых у одного пациента, на одно стекло, особенно если количество взятого материала незначительное, и располагать мазки ближе к центру предметного стекла для удобства микроскопии.
6.Солевой раствор для приготовления нативного (влажного) препарата дол-
жен быть теплым (оптимально 37 С). При этой температуре подвижность трихомонад лучше сохраняется во время микроскопии.
Инструменты, которыми лучше всего брать клинический материал – это пластиковые бактериологические петли разного объема и ватные или дакроновые тампоны. Для приготовления нативного препарата всегда берется одно стекло, готовится препарат методом «раздавленной капли». Материал, взятый бактериологической петлей, наносится штрихами на предметное стекло. Если материал взят дакроновым/ватным тампоном, последний прокатывается по стеклу для нанесения материала.
Все взятые у пациентов материалы и приготовленные из них препараты для направления их в лабораторию должны быть высушены на воздухе и обязательно промаркированы.
4.1.Взятие материала для нативных препаратов
Уженщин для микроскопического исследования влажных (нативных) препаратов используют выделения из влагалища, у мужчин влажные препараты готовят при наличии обильных выделений из уретры. Если выделений нет, то влажный препарат готовят из смыва уретры.
Вагинальный образец для приготовления влажного препарата берут в зеркалах бактериологической петлей объемом 10 мкл с определенного участка слизистой оболочки влагалища (задний или боковой свод). Материал из уретры берут бактериологической пластиковой петлей объемом 1 мкл. Из препуциального мешка материал берут ватным/дакроновым тампоном.
На предметное стекло наносят каплю теплого физиологического раствора
(оптимально 37 С). Вагинальные или уретральные выделения смешивают с каплей физиологического раствора, накрывают покровным стеклом (метод раздавленной капли) и сразу просматривают с использованием светового микроскопа. Если нет условий для микроскопии в кабинете врача, выделения помещают в пробирку с теплым физиологическим раствором (1-2 мл) и немедленно направляют в лабораторию, где готовят нативный препарат и проводят микроскопическое исследование.
14
4.2. Получение клинического материала для окрашенных препаратов
4.2.1. Получение клинического материала у мужчин
Образец из уретры для окрашивания по методу Грама или метиленовым синим берут с помощью пластиковой бактериологической петли объемом 1 мкл. При наличии выделений из уретры поверхность головки полового члена и область наружного отверстия уретры следует обработать с помощью марлевого тампона и отведением крайней плоти назад для полного обнажения головки. Если нет выделений из уретры, следует провести легкий массаж скользящими движениями от основания полового члена к головке. Для взятия материала может быть использован дакроновый/ватный тампон. При взятии материала из уретры пластиковой бактериологической петлей петля вводится в уретру на 1– 2 см, плоскость «глазка» петли следует продвигать к отверстию, слегка нажимая петлей на стенку уретры. Вращение петли во время взятия материала недопустимо ввиду возможной травматизации уретры. Петля с взятым материалом накладывается на предметное стекло и с легким нажатием передвигается по нему так, чтобы осталась тонкая полоска клинического материала.
Образец из препуциального мешка берут ватным/дакроновым тампоном.
4.2.2. Получение клинического материала у женщин
Из уретры образец для окрашивания по Граму или метиленовым синим берут с помощью пластиковой бактериологической петли объемом 1 мкл. При обильном количестве выделений наружное отверстие уретры следует обработать марлевым тампоном. Если нет свободных выделений из уретры, врач проводит легкий массаж уретры. Пластиковую петлю объемом 1 мкл вводят на глубину 1–2 см, плоскость «глазка» петли нужно, прижимая к стенке уретры, продвигать к отверстию, захватывая заднюю и боковые стенки уретры. Не рекомендуется вращать петлю во время этой процедуры. Клинический материал наносится на предметное стекло. Петля передвигается по нему несколько раз с легким нажимом и оставляет на стекле тонкую полоску клинического материала.
Клинический образец из цервикального канала шейки матки берут в зеркалах. Для взятия материала используют ватный/дакроновый тампон, специальную щеточку или ложечку. Наружное отверстие цервикального канала необходимо тщательно обработать от вагинальных выделений с помощью ватного или марлевого тампона, чтобы предотвратить возможную контаминацию. Тампон вводится в цервикальный канал на глубину 1–2 см и несколько раз вращается. Клинический материал с тампона переносят на предметное стекло, прокатывая его по стеклу.
Клинический материал из влагалища берут в зеркалах из заднего и с боковых сводов бактериологической петлей объемом 10 мкл и наносят тонким слоем на предметное стекло.
15
4.3. Получение клинического материала из экстрагенитальных локусов
4.3.1. Получение клинического материала из прямой кишки
Клинический материал из прямой кишки берут в том случае, если пациент имел анальный сексуальный контакт, а также при клинических проявлениях проктита. Также материал из прямой кишки берут у женщин и детей при обследовании на гонококковую инфекцию и при наличии воспалительного процесса на коже перианальной области; при наличии аногенитальных бородавок.
Материал для исследования получают с помощью ректоскопа под контролем глаза либо «слепым» методом через анальное отверстие. Взятие материала при ректоскопии является идеальным, так как позволяет получить одновременно представление о состоянии слизистой оболочки прямой кишки. Материал берут ватным тампоном со стенки прямой кишки. Тампон вводят на глубину 2–3 см и производят взятие материала со всех стенок прямой кишки по направлению изнутри кнаружи и затем круговыми движениями. Материал наносят на предметное стекло путем прокатывания тампона.
Наиболее информативно это исследование бывает при наличии гнойного отделяемого.
Внимание! При наличии на тампоне каловых масс тампон выбрасывается и проводится повторное взятие материала. При использовании ректоскопа каловые массы могут быть удалены. Сбор материала производят при визуальном контроле.
4.3.2. Получение клинического материала из гортани
Из гортани материал берут у пациентов, имевших оральный сексуальный контакт или при подозрении на него. Тампоном проводят по задней стенке глотки за нижним краем мягкого неба, а также по поверхности миндалин. Полученный материал наносят на предметное стекло путем прокатывания тампона.
4.3.3. Получение клинического материала с конъюнктивы глаза
При наличии гнойных выделений они удаляются стерильным ватным тампоном. Отводится нижнее веко и другим стерильным тампоном проводится по поверхности нижнего века по направлению к внутреннему углу глаза. Взятый материал наносят на предметное стекло путем прокатывания тампона.
Глава 5. ТРАНСПОРТИРОВКА МАТЕРИАЛА
Для проведения прямой микроскопии нативных препаратов необходимо срочно (в течение нескольких минут) после взятия клинического материала
16
доставить его в лабораторию при соблюдении температурных режимов (30– 37°С). При наличии определенного опыта врач акушер-гинеколог, дерматовенеролог или уролог на приеме может провести микроскопическое исследование нативного препарата, обнаружить возбудителя заболевания и неотложно назначить лечение.
Клинический материал для дальнейшего микроскопического исследования окрашенных препаратов наносят параллельно на 2 чистых, сухих, обезжиренных предметных стекла. Мягким движением, не втирая, материал распределяют по поверхности предметного стекла инструментом для получения материала. После этого стекла необходимо высушить на воздухе при комнатной температуре, избегая соприкосновения их друг с другом. Образцы для исследования маркируют с указанием клинического материала. Затем стекла помещают в контейнер для транспортировки, заполняют направление с указанием фамилии пациента, № истории болезни, даты взятия материала, характера клинического материала, метода исследования, предполагаемого диагноза и отправляют в лабораторию.
В случае несоблюдения правил взятия и условий доставки биологического материала (разбитые, не промаркированные, склеенные друг с другом, не высушенные стекла, отсутствие материала на стекле, а также несоответствующие сопроводительные документы) образцы не подлежат микроскопическому исследованию, об этом сообщается врачу, направившему клинический материал на исследование. Такие образцы подлежат утилизации.
При необходимости хранения материала более 24 часов после высушивания каждый образец должен быть зафиксирован либо 96% спиртом в течение 3 минут, либо в пламени горелки. В направлении должно быть указание на проведенную фиксацию.
Глава 6. МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ
6.1. Окраска водным раствором метиленового синего
Процедура окрашивания:
1.Препарат высушивают на воздухе и фиксируют погружением на 3 мин в 96% этиловый спирт
2.Фиксированный препарат высушивают, затем на него наносят 1% водный раствор метиленового синего на 1–10 мин (в зависимости от материала)
3.Оставшийся краситель тщательно смывают струей холодной воды
4.Высушивают на воздухе.
6.2. Окраска метиленовым синим по Леффлеру
Процедура окрашивания:
1. Препарат высушивают на воздухе
17
2.Высушенный препарат погружают в емкость с 1% раствора метиленового синего по Леффлеру на 1–2 мин.
3.Оставшийся краситель тщательно смывают струей холодной воды или погружением в емкость с водой
4.Высушивают на воздухе или фильтровальной бумагой.
Окрашенные препараты исследуют с использованием светового микроскопа (окуляры х7 или х10, объективы х10, х40, а также х100). Мазок на стекле окрашивается в синий цвет. Ядра клеток окрашены в синий цвет, цитоплазма — в голубой цвет разной интенсивности. Микрофлора окрашивается в синий цвет разной интенсивности.
6.3. Окраска по методу Грама
Окраска по методу Грама, кроме выявления морфологии бактерий, разделяет их на две группы. Бактерии в зависимости от содержания пептидогликана в клеточной стенке обладают способностью по-разному удерживать краситель кристаллический фиолетовый, т.е. обесцвечиваться или не обесцвечиваться спиртом. По результатам окрашивания одни бактерии выглядят при микроскопии фиолетовыми (грамположительные бактерии), другие – розовыми (грамотрицательные бактерии).
Некоторые виды бактерий невозможно дифференцировать при окраске по методу Грамма. Это касается не имеющих клеточной стенки микоплазм, очень мелких размеров клеток хламидий, и других бактерий, требующих особых методов окраски (например, кислотоустойчивых микобактерий). Ряд микроорганизмов могут изменять тинкториальные свойства и окрашиваться грамвариабильно, в зависимости от возраста культуры и под действием повреждающих факторов, например, антимикробных препаратов.
Процедура окрашивания:
1.Препарат высушивают, фиксируют над пламенем горелки несколько секунд. На фиксированный препарат наносят 1% водный раствор кристаллического (или генцианового) фиолетового на 1 мин.
2.На стекло наносят раствор Люголя примерно на 30 сек.
3.Препарат обесцвечивают 96% спиртом до тех пор, пока наиболее тонкие участки препарата не станут бледно-серыми, а стекающая с препарата жидкость не станет бесцветной, что занимает, примерно, 15–30 сек. в зависимости от плотности мазка. Нужно избегать излишнего обесцвечивания, так как это может повлиять на дифференциацию бактерий по цвету.
4.Препарат промывают проточной водой
5.Дополнительно окрашивают препарат фуксином в течение 3 мин. Допускается докрашивание 1% раствором нейтрального красного или сафранина.
6.Краситель сливают со стекла, препарат промывают проточной водой, снимают влагу фильтровальной бумагой и досушивают на воздухе.
Микроскопическое исследование начинают с малого увеличения (объектив х10), затем переходят на большое увеличение (объектив х40), далее используют
18
иммерсионный объектив (объектив х100 иммерсионный), окуляры х7 или х10. При правильной окраске по Граму клетки крови – нейтрофилы, мононуклеары, эпителий и другие клетки имеют розовый цвет. Высокое качество окраски по Граму обеспечивается своевременным прекращением обесцвечивания мазков. При недообесцвечивании грамотрицательные бактерии могут сохранять фиолетовую окраску, а в переобесцвеченных мазках грамположительные микробы приобретают розовый цвет.
Глава 7.
МЕТОДИКА МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРОХОДЯЩЕМ СВЕТЕ
Метод светлого поля является основным при исследовании объекта в проходящем свете. Для этого метода необходимо иметь микроскоп проходящего света, объективы светлого поля (х4, х10, х20, х40), конденсор, осветитель. Световой поток от осветителя направляется в конденсор и линзами конденсора пучок света от источника света направляется на плоскость препарата. Конденсор создает световой конус, обеспечивающий заполнение светом входное отверстие (апертуру) объектива.
Порядок работы:
1.Установить стекло с препаратом на предметный столик микроскопа и зафиксировать держателями его положение
2.Поворотом револьверного устройства установить объектив х4 или х10
3.Макрометрическим и микрометрическим винтами, глядя в окуляр микроскопа, получить изображение объекта
4.Раскрыть апертурную диафрагму конденсора
5.Поднять конденсор до положения наибольшей яркости освещения в плоскости объекта. Далее яркость света и освещенность препарата следует регулировать только диафрагмой.
Целью микроскопического исследования является описание микроорганизмов и клеток. Исследование препарата проводят при различных увеличениях микроскопа с использованием объективов разной оптической силы, начиная с малого увеличения с переходом к большому. При этом происходит сокращение видимой части препарата. При увеличении х4 можно видеть большое число эпителиальных клеток в поле зрения, но невозможно рассмотреть ни одного микроорганизма, их размер лежит за пределами разрешающей способности объектива малого увеличения. Информация, поступающая при каждом последующем увеличении микроскопа, должна удерживаться в памяти специалиста и создавать в его воображении картину всего препарата во всех его деталях. Можно представить себе процесс микроскопической оценки, поделенный на несколько уровней в зависимости от разного увеличения микроскопа. На каждом этапе могут быть сделаны некоторые заключения об объектах, которые можно четко видеть, и некоторые предположения об объектах, которые видны
19