Микроскопические методы исследования в клинической лабораторной диагностике заболеваний урогенитального тракта. Общие принципы Методические рекомендации

УДК 616-076 ББК 53.4

М59

М59 Микроскопические методы исследования в клинической лабораторной диагностике заболеваний урогенитального тракта. Общие принципы. Методические рекомендации. / Е.В. Спасибова, К.В. Шалепо, О.В. Будиловская, Т.А. Хуснутдинова, А.А. Крысанова, Е.В. Шипицына, С.В. Воробьев, А.М. Савичева. – СПб.: СПбГПМУ, 2018. – 24 с.

ISBN 978-5-907065-14-7

В методических рекомендациях представлены основные принципы микроскопических методов исследования в клинической лабораторной диагностике. Подробно описаны устройство разных типов микроскопов, основы получения изображений микрообъектов с дополнительными методами контрастирования, техника работы и правила ухода за микроскопом. Особое внимание уделено преаналитическому этапу лабораторных исследований, а именно, получению клинического материала, его хранению, доставке в лабораторию, приготовлению препаратов для микроскопических методов исследования. Методические материалы предназначены для специалистов клинической лабораторной диагностики, бактериологов, акушеров-гинекологов, урологов, дерматовенерологов, инфекционистов, врачей общей практики, лаборантов, медицинских техников и др. Методические рекомендации могут быть использованы в качестве учебных материалов при подготовке студентов медицинских ВУЗов, а также при различных формах последипломного обучения.

Рецензенты:

Королюк Александр Михайлович – д.м.н., профессор, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии лабораторной диагностики ФГБОУ ВО СПБГПМУ Минздрава России.

Эмануэль Владимир Леонидович – д.м.н., профессор, заведующий кафедрой клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины, директор на- учно-методического центра МЗ РФ по молекулярной медицине на базе СПбГМУ им. И. П. Павлова.

УДК 616-076 ББК 53.4

Утверждено учебно-методическим советом Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

2

3

Глава 1. МИКРОСКОП И УХОД ЗА НИМ

1.1. Устройство микроскопа

Прямая световая микроскопия позволяет рассматривать как неокрашенный (нативный), так и окрашенный препарат путем транслюминесцентного просвечивания, то есть в проходящем свете. Микроскоп проходящего света плоского поля – это классический микроскоп для медико-биологических исследований, а также основная часть систем анализа изображений (видеоанализаторов).

Современный микроскоп состоит из следующих компонентов:

1.Штатив

2.Механическая часть

3.Оптическая система

Штатив – это основание, на которое крепится весь микроскоп и в котором может быть расположен осветитель проходящего света с источником и блоком питания или без них.

Механическая часть микроскопа обеспечивает крепление и движение оптической части и препарата. К механической части относится предметный столик с держателем и водителем объекта, а также фокусировочный механизм, который обеспечивает движение столика или объектива для установки определенного расстояния между объектом наблюдения и оптической частью.

Оптическая система обеспечивает основную функцию микроскопа – создание увеличенного изображения объекта с высокой степенью достоверности по форме, цвету и размеру. Оптика микроскопа должна обеспечивать увеличение, контраст и разрешение элементов, позволяющие произвести наблюдение, измерение и анализ, которые соответствуют методике. Оптическая часть микроскопа состоит из системы линз конденсора под предметным столиком, объективов и окуляров. Вспомогательными элементами оптической системы являются: осветительная система и насадки для визуализации изображения (видео/фото камеры).

Конденсор – это часть оптической системы, которая не увеличивает изображение, а предназначена для увеличения количества света, поступающего в микроскоп. Он концентрирует луч света на препарат. В микроскопах проходящего света конденсор расположен между источником света и объектом на предметном столике. Диафрагма, расположенная под самим конденсором, позволяет контролировать диаметр пучка света, проецируемого на объект. Контрастность изображения может быть усилена уменьшением диафрагмы конденсора, так как происходит уменьшение количества рассеянного света. Чаще это используется для влажных и равномерно окрашенных препаратов. Однако это приводит к сужению поля зрения. Конденсор не следует двигать с целью настройки интенсивности света.

Объектив – основной оптический элемент микроскопа, от которого зависит основная функция работы микроскопа. Оптические и механические системы

5

прямо или косвенно зависят от функций объектива. Объективы предназначены для построения изображения в некой плоскости (плоскости изображения) с определенным увеличением, соответствующей точностью разрешения элементов и воспроизведением по форме и цвету объекта. Объективы имеют сложную конструкцию, состоящую из нескольких одиночных или склеенных компонентов из двух и более линз. Объективы собирают отражаемый объектом свет и дают увеличение на некотором расстоянии выше линзы. В медицинской практике для микроскопического метода обычно используют 4-кратную сканирующую линзу, 10-кратную промежуточную линзу, 40-кратную линзу большого увеличения и линзу со 100-кратным увеличением для микроскопии с масляной иммерсией. Наилучшими оптическими характеристиками обладают планобъективы (планахроматы и планапохроматы), которые обеспечивают резкое изображение по всему полю наблюдения и минимальные цветовые аберрации. Объективы микроскопов плоского поля рассчитаны на работу с предметным стеклом, которое имеет стандартную толщину 1,0±0,1 мм. Толщина покровного стекла зависит от объекта наблюдения и модификации микроскопа. При работе с предметным стеклом она составляет 0,17 мм, для камеры Горяева 0,5 мм, для инвертированных микроскопов эта величина может доходить до 5 мм в зависимости от толщины стенок или дна лабораторной посуды.

Третья часть оптической системы – окуляры. Это обращенная к глазу часть микроскопа, которая предназначена для рассматривания с увеличением в 10– 15 раз изображения, созданного с помощью объектива. Окуляр состоит из двух линз: глазной – ближайшей к глазу наблюдателя и полевой – ближайшей к плоскости, в которой объектив строит изображение исследуемого объекта.

Общее увеличение системами линз в микроскопе определяется умножением показателя увеличения объектива микроскопа на увеличение окуляра. Наличие видеоадаптеров и насадки с оптическими свойствами могут влиять на общее увеличение микроскопа как в большую сторону, так и в сторону уменьшения. Например, микроскоп имеет окуляр х10, объектив х100, оснащен видеоадаптером х0,63 и насадкой х1,5. Общее увеличение такого микроскопа будет состав-

лять 10*100*0,63*1,5=х945.

В систему анализа изображений наряду со световым микроскопом входят компьютер с программным обеспечением, цифровые камеры, видеоадаптеры.

1.2. Настройка микроскопа

Правильное использование микроскопа и правильный уход за ним является важным фактором, определяющим качество микроскопии и интерпретацию результатов.

Основные исследования в медицинской практике проводятся в проходящем свете, следовательно, особое внимание следует уделить настройке освещения в микроскопе, которое улучшит качество изображения.

Метод светлого поля не требует дополнительных или специальных принадлежностей. Неправильно настроенный микроскоп может дать искажения геометрии и цветопередачи объекта. При работе с бинокулярной насадкой, сначала

6

необходимо произвести раздвижку окулярных трубок по глазной базе. Далее в окулярные трубки вставить выбранные окуляры. Выставить «0» по шкале диоптрийной наводки левой окулярной трубки или на обеих трубках, или на самих окулярах, если в них существует диоптрийная подвижка. В револьверное устройство установить объективы по часовой стрелке в порядке возрастания увеличения. В специальную откидную оправу под конденсором вставить матовое стекло (светофильтр).

1.3.Порядок выполнения настройки освещения по Келлеру

1.Включите источник освещения. Настройте яркость освещение таким образом, чтобы свет наиболее приятно воспринимался глазами.

2.Закрепите контрастный образец на столе микроскопа. Установите 10х объектив.

3. Откройте максимально полевую и апертурную диафрагмы.

7

4.Поднимите конденсор в крайнее верхнее положение. Сфокусируйтесь на образце с помощью макро- и микровинтов.

5.Максимально закройте полевую диафрагму.

6.Опускайте конденсор постепенно вниз, чтобы в плоскости образца появилось резкое изображение закрытой полевой диафрагмы. Если освещаемая часть находится в центре, то конденсор настроен правильно.

В противном случае необходимо отрегулировать конденсор с помощью центровочных винтов.

8

7. Откройте полевую диафрагму почти полностью так, чтобы границы не приближались вплотную к краю поля зрения. При необходимости повторно произведите центровку.

8. Откройте полностью полевую диафрагму

9.Следующие действия выполняются для настройки контрастности изображения. Помните: апертура осветительной системы должна составлять 70–80% апертуры объектива.

Достаньте окуляр и, наблюдая в окулярный тубус, закройте апертурную диафрагму на 80% от числовой апертуры объектива. Таким образом уменьшится видимое световое пятно на треть.

9