Методические рекомендации по применению метода идентификации породной принадлежности медоносных пчел Apis mellifera, основанной на полиформизме локуса COI-COII метохондриальной ДНК с применением технологии полимеразной цепной реакции ПЦР

из сухих пчел, хранившихся в течение 1 и 6 месяцев при комнатной температуре;

из пчел, помещенных живыми в 96%-ный этанол и хранившихся в течение 1 месяца при -100С, а также в течение месяца при комнатной температуре.

Выделение ДНК проводили по стандартной методике. Проверка качества выделенной ДНК проводилась электрофоретическим методом в

0,8%-ном агарозном геле. Было показано, что ДНК из пчел, помещенных живыми в 96%-ный этанол и хранившихся в течение 1 месяца при -100С пригодна для дальнейших работ и данные требования нами рекомендуются соблюдать при выполнении дальнейших молекулярных исследований.

6. Методика проведения молекулярно-генетических исследований пчел

Выделение ДНК из индивидуальных особей проводят модифицированным методом экстракции смесью гуанидинтиоционат-фенол- хлороформ (Сhomezynski, Sacchi, 1987). Для этого у пчел выделяют кишечник, грудные мышцы и растирали в 0,5 мл буфере, содержащего 4М гуанидинтиоционата, 25мМ цитрата натрия, 100 мМ 2-меркаптоэтанола и 0,5% саркозила. Затем к лизату добавляют 0,1 объема 2М трис-HCl-буфера pH 8,0 и энергично встряхивают с равным объемом водонасыщенного фенола рН 8,0 и 0,2 объемами смеси хлороформ-изоамилового спирта (24:1) 15 мин. Смесь выдерживают 15 мин при 00С и центрифугируют в течение 10 мин при 10000g. Вводно-солевую фазу, содержащую ДНК, отбирают и смешивают с равным объемом изопропанола. Препарат ДНК выдерживают при -200 С до оформления видимого осадка и центрифугируют 10 мин при

10000g (центрифуга MPW-50) (Smth, Brown, 1988). Осадок, содержащий ДНК, подсушивают, растворяют в лизирующем буфере и повторно осаждают добавлением двух объемов 96%-ного этанола. Осадок ДНК промывают 70%-ным этанолом, высушивают и растворяют в минимальном объеме бидистиллированной воды.

Амплификацию мтДНК проводят методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в термоциклере «Циклотерм» в 50мкл реакционной смеси, содержащей буфер для Taq-полимеразы (10мМ трис-HCl, рН 8,8; 50мМ KCl; 2,5 мМ MgCl2 и 0,01% желатина), около 1 мкл суммарной ДНК, 10 пкмоль каждого праймера, 250 мкмоль каждого dNTP и 2,5 ед. Taqполимеразы под слоем вазелинового масла. Реакцию проводят в 40 циклов: 950 – 1 мин, 500 – 2 мин, 720 – 2 мин. После завершения процесса амплификации смесь дополнительно инкубируют при 720С в течение 7 мин с целью исключения присутствия не полноразмерных фрагментов в препарате

(Chomezynski, Sacchi, 1987).

12

Фракционирование и электрофоретический анализ продуктов амплификации проводят в 1,5%-ном агарозном геле, приготовленном на буфере следующего состава: 50мМ трис-ацетат, рН 7,6 и 2мМ ЭДТА. После окончания электрофореза гель окрашивали в растворе бромистого этидия и просматривали в проходящем УФ-свете с длиной волны 312 нм (трансил-

люминатор ТМ-36 фирмы «UV-Products» (Vieira, Messing, 1987).

Клонирование амплифицированных фрагментов осуществляют с применением dtpBluescript, приготовленного на основе pBluescript II KS (-) (Stratagene, США), расщепленной по сайту EcoRV. Компетентные клетки реципиентного штамма XL-Blue готовят с применением MnCl2 (Vieira, Messing, 1987).

Определение первичной структуры клонированных фрагментов ДНК проводят ферментативным дидезокси-методом Сэнджера с помощью набора для секвенирования Т7 ДНК-полимеразой («Pharmacia», Швеция). Секвенирующий электроферез проводят в 5-6%-ном клиновидном (0,2- 1,0мм) полиакриламидном геле в трисборатном буфере с 7М мочевиной при мощности 65Вт и температуре 550С в приборе «Макрофор» (LKB,

Швеция) (Sanger, Nicklen, Coulson, 1977).

Анализ нуклеотидной последовательности осуществляют с использованием пакета программ Lasergene (DNASTAR, США).

7. Результаты апробации полимеразной цепной реакции основанной на полиморфизме межгенного участка COI-COII мтДНК

Пробы пчел отобрали из 127 семей, занимающих ульи и борти, породную принадлежность устанавливали по стандартным бонитировочным признакам.

ДНК-анализ основан на полиморфизме межгенного участка COICOII мтДНК и на полимеразной цепной реакции, которые позволяют оценить гетерогенность семей благодаря наследованию исследуемого признака по материнской линии.

У пчел среднерусской породы участок мтДНК между COI-COII вы-

глядит следующим образом 3΄-конец гена COI-ген тРНКLeu - элемент Р - элемент Q - элемент Q – 5 ΄- конец гена COII; у пчел кавказской породы: 3΄-конец гена COI - ген тРНКLeu - элемент Q – 5 ΄ - конец гена COII. Длина исследуемого фрагмента мтДНК кавказских пчел составляет 350пн, у среднерусских – 600 пн.

Результаты проведенных исследований показали наличие аллеля Q в трех семьях и аллеля РQQ в 124 (табл. 1). Выявление семей с аллелем Q свидетельствует о неточности традиционного метода породной идентификации пчел, так как обследованные семьи появились в процессе обновления и восстановления генофонда пасек за счет отобранных чистопородных

13

семей после морфометрической оценки пчел. Вполне возможно, что наблюдаемые «пятна» генетических загрязнений – это отдаленные последствия залетов роев с близлежащих пасек.

Такой умеренный приток генов не должен вызывать серьезных нарушений в генофонде субпопуляции. К тому же при бортевом содержании интенсивность естественного отбора значительно выше, что также должно обеспечить стабильность генофонда. Тем не менее обнаружение семей с аллелем Q заставляет внимательнее относиться к проведению селекционной работы.

Таблица 1. Встречаемость аллелей PQQ и Q полиморфного локуса COI-COII мтДНК медоносной пчелы (Apis mellifera) в субпопуляции пчел запо-

ведника «Шульган-Таш» Бурзянского района Республики Башкортостан

*Средние частоты

Таким образом, проведенные нами исследования показывают, что высокая чувствительность метода полимеразной цепной реакции основанного на полиморфизме межгенного участка COI-COII мтДНК медоносной пчелы дает возможность оценить уровень гетерогенности каждой семьи даже при сравнительно небольшой выборке особей. По предварительным исследованиям, удалось выявить наиболее достоверную картину породности пчел заповедника Шульган-Таш. В данном районе наблюдается умеренный приток генов кавказских пчел, что на наш взгляд не должно вызвать серьезных нарушений в генофонде субпопуляции аборигенных Apis mellifera. К тому же при бортевом содержании интенсивность естественного отбора значительно выше, что также должно обеспечить стабильность генофонда. Тем не менее, обнаружение семей с аллелем Q заставляет внимательнее относиться к проведению селекционно-племенных работ с применением молекулярно-генетических технологий.

14

Библиографический список

1.Алтухов Ю.П. Генетические процессы в популяциях: Учеб. пособие 3-е изд., перераб. и доп. – М.: ИКЦ «Академкнига», 2003. – 431 с.

2.Никоноров Ю.М., Беньковская Г.В. и др. Использование метода ПЦР для контроля чистопородности пчелосемей Apis mellifera mellifera L.

вусловиях Южного Урала // Генетика. 1998. №334. С.1574-1577.

3.Смирнов А.М., Туктаров В.Р. Новое в обработке экстерьера // Пчеловодство, 1991, №3, С.4-6.

4.Bentzen P., Wright J.M., Bryden L.T., Sargent M., Zwanenburg K.C.T. Tandem repeat polymorpnism in the mitochondrial control region of redfishes (Sebastes: Scorpaenidae // J. Heridity. 1998. Vol.89. P.1-7.

5.Ferris S.D., Berg W.J. The utility of mitochondrial DNA in fich genetics and manageht // Population genetics and fishery management / Eds N. Ryman, F. Utter. Seattle; L.: Univ. Wash. press, 1987. P. 277-301.

6.Crozier R.H., Croziee Y.C. The mitochondrial genome of the Honeybee Apis mellifera: complete sequence and genome organization // Genetics. 1993. V.133. P.97-117.

7.Chomezynnski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum ihiocyanate-phenol-chlorophorm extration // Anal. Biochem. 1987. V.162. P.156-159.

8.Cornet J.-M.L., Garnery L., Solignac M. Pupative origin and function intergenic region between COI-COII of Apis mellifera L. mitochondrial DNA // Genetics. 1991. V.128. P.393-403.

9.Vieira J., Messing J. Production of single-stranded plasmid DNA // Methods in enzymology. N.Y. Acad. Press, Inc., 1987. V. 153. Part D. P. 3-11.

10.Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chainterminating inhibitors // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1977. V.74. P.5463-5467.

11.Smith D.R., Brown W.M. Polymorphisms in mitochondrial DNA of European and Africanized honeybees (Apis mellifera) // Experientia. 1988. V.44. P.257-260.

Словарь-справочник основных терминов Аллели – формы состояния гена. Аллели локализованы в одинако-

вых локусах гомологичных хромосом и определяют направление развития признака. Каждый ген находится не менее чем в двух аллельных состояниях – доминантная и рецессивная аллели.

Аминокислота (ы) – класс органических соединений, содержащих карбоксильные (-COOH) и аминогруппы (-NH 2) и обладающих свойствами, как кислот, так и оснований. В природе существует свыше 150 амино-

15

кислот. Около 20 из них служат важнейшими мономерными блокамизвеньями, из которых построены все белки. Аминокислоты участвуют в обмене веществ организмов, являясь исходными соединениями при биосинтезе гормонов, витаминов и других веществ.

Бонитировка – комплексная оценка животных по совокупности признаков и распределение их на классы в соответствии с этой оценкой. Бонитировку проводят ежегодно в соответствии с инструкцией Министерства сельского хозяйства.

Вид – группа морфологически сходных организмов, имеющих общее происхождение и потенциально способных к скрещиванию между собой в естественных условиях. Характерной биологической особенностью вида домашних животных является высокая внутривидовая изменчивость, вызванная широким различием между породами, что позволяет эффективно проводить селекцию.

Ген – элементарная единица наследственности, представляющая собой отрезок дезоксирибононуклеиновой кислоты (ДНК). Ген обладает определенной биохимической функцией, формирует и изменяет признак. Главная функция гена – программирование синтеза ферментных и других белков. Наследственная детерминация признака обусловлена эффектом одного или многих генов. В более общей формулировке можно сказать, что ген – это отрезок ДНК, контролирующий определенный биохимический процесс при формировании генотипа особи.

Генетический полиморфизм – одновременное присутствие в популяции нескольких аллелей одного и того же локуса, находящихся в равновесии в течение ряда генераций. Генетический полиморфизм может иметь такое состояние, когда ген с селекционным преимуществом постепенно вытесняет второй ген из популяции. Генетический полиморфизм используют в селекции для повышения эффективности, и в частности для характеристики генетической структуры популяции, контроля происхождения потомков, выявления связи с продуктивностью, плодовитостью, наследственными болезнями и степень адаптации животных.

Генотип – совокупность генов, локализованных в хромосомах организма. Он определяет племенную и селекционную ценность животного, а также норму реакции на все возможные условия среды. Генотип можно рассматривать как систему взаимодействия всех генов. Взаимодействие генотипа с внешней средой обусловливает фенотипическое проявление признаков.

Генофонд – совокупность генов одной популяции, характеризующихся определенной частотой. Изучение особенностей наследственно обу-

16

словленных признаков популяции животных и определение частот различных генов имеют большое значение в селекции, особенно при разработке мероприятий по сохранению и улучшению генофонда локальных пород. Внутри породы структурные единицы – линии, отродья и семьи также различают генофондом.

Гибрид – организм, полученный в результате скрещивания разнородных в генетическом отношении родительских форм (видов, пород, линий и т.п.). Процесс такого скрещивания называется гибридизацией. Скрещивание особей одного вида (его подвидов, сортов, пород или линий) называют внутривидовой гибридизацией; скрещивание особей из различных видов или родов называют отдаленной гибридизацией. Отличают естественно происходящую в природе спонтанную гибридизацию и искусственную гибридизацию. Гибридизация обычно сопровождается явлением гетерозиса. Возможно гибридизация не на основе полового процесса, а получение гибридизированных соматических клеток. При этом сливаются их ядра. Такую гибридизацию производят в искусственных условиях – при пониженных температурах, в присутствии некоторых вирусов и т.п. В молекулярной биологии говорят о молекулярной гибридизации между разными молекулами ДНК или между ДНК и РНК.

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) – сложный биополимер,

состоящий из мономеров – нуклеотидов. Каждый нуклеотид включает три компонента – остаток фосфорной кислоты (фосфат), пентозный сахар (дезоксирибозу) и одно из четырех азотистых оснований: или пуриновых (аденин или гуанин), или пиримидиновых (тимин или цитозин).

Коадаптация – взаимное приспособление в ходе эволюции, например: разных форм живого, обитающих совместно, разных органов одной особи.

Локус – участок хромосомы, в котором локализован ген. Тесно сцепленные между собой независимо действующие гены образуют сложный локус; жизненно важные гены, при элиминации или мутировании которых возникает летальный исход, образует витальный локус.

Митохондрия – органоид цитоплазмы животных и растительных клеток (эукариот) в виде нитевидных или гранулярных образований, обеспечивающих клетку энергией. Состоят из белка, липидов, РНК и ДНК. Служат центрами клеточного дыхания и распределения энергии обмена веществ внутри клетки (в результате окислительно-восстановительных реакций). В митохондриях вырабатывается АТФ. Митохондрия функционирует 5-10 дней и имеет сложную морфологическую структуру, варьирующую с их формой. Число митохондрий в одной клетке – от единиц до не-

17

сколько тысяч. М. также участвует в передаче наследственной информации. Митохондрии описаны немецким анатомом и гистологом Р. Альтма-

ном (1852-1901) в 1884 году.

Мутация – естественно возникающие или вызываемые искусственно (химическими веществами, радиацией и др. факторами) изменения наследственных свойств организма (его генотипа), происходящие в результате нормальных перестроек и нарушений в генетическом материале организма.

Нуклеотиды – фосфорный эфир нуклеозида, состоящий из азотистого основания (пуринового или пиримадинового), углевода (рибозарибонуклеотиды или дезоксирибозы – дезоксирибонуклеотиды) и остатки фосфорной кислоты. Соединения из одного, двух, трех, нескольких или многих нуклеотидов называют соответственно моно-, ди-, три-, олиго-, полинуклеотидами. Нуклеотид - составная часть нуклеиновых кислот, коферментов и др. биологически активных соединений. Название нуклеотида производится от наименования азотистого основания. Молекулярная масса одного мононуклеотида достигает 330 полинуклеотидов.

Подвид - таксономическая категория (ранг) в систематике животных и растений, совокупность географически (реже экологически) обособленных популяций одного вида, особи которых отличаются достаточно устойчивыми признаками от особей других популяций того же вида.

Популяционная генетика – раздел общей генетики, изучающий генетическую структуру и динамику генетического состава популяций.

Популяция – совокупность особей одного вида, длительно занимающая определенное пространство и воспроизводящая себя в течение большого числа поколений. В современной биологии популяция рассматривается как элементарная единица процесса эволюции, способная реагировать на изменения среды перестройкой своего генофонда.

Порода – группа сходных по генетически обусловленным хозяйст- венно-биологическим свойствам и морфологическим признакам животных общего происхождения и одного вида, предъявляющих сходные требования к природным и производственным условиям. Порода имеет сложную структуру, состоящую из зональных типов, производственных типов, линий и семейств. Различают породы примитивные, заводские и переходные. В зоологическом смысле породу можно рассматривать как подвид.

Раса – экологически, поведенчески, а иногда и физиологоморфологически обособленная совокупность особей; популяция, их группа внутри одного вида; различают экологические, географические и др. расы.

Трансляция – биосинтез полипептидных цепей белков, идущий в клетке путем считывания генетической информации, записанной в виде

18

последовательности нуклеотидов в молекулах информационных, или матричных РНК. Перевод генетической информации с и-РНК в структуру специфических белков осуществляется путем синтеза аминокислот в последовательности, соответствующей записанному на и-РНК генетическому коду. Порядок аминокислот в строящейся полипептидной цепи и определяет структуру синтезируемого белка. Аминокислоты к месту синтеза белков доставляются транспортной РНК (т-РНК).

Таксон – теория и практика научной систематики и классификации. Раздел систематики, учение о соподчинении таксономических категорий – таксонов – от видов до систематических царств.

19