Методические рекомендации по применению метода идентификации породной принадлежности медоносных пчел Apis mellifera, основанной на полиформизме локуса COI-COII метохондриальной ДНК с применением технологии полимеразной цепной реакции ПЦР

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.АКМУЛЛЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

по применению метода идентификации породной принадлежности медоносных пчел Apis mellifera, основанной на полиморфизме локуса

COI-COII митохондриальной ДНК с применением технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР)

УФА 2009

УДК 108 ББК 81

М 90

Печатается по решению учебно-методического совета Башкирского государственного педагогического университета им. М. Акмуллы

Методические рекомендации разработаны: (Всероссийский научноисследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии) А.М.Смирнов, (Башкирский государственный педагогический университет им. М.Акмуллы) В.Н.Саттаров, (Башкирский государственный аграрный университет) В.Р.Туктаров. – Уфа: Изд-во БГПУ, 2009. – 20 с.

Методические рекомендации предназначены для использования при идентификации породной принадлежности и проведении популяционногенетических исследований медоносной пчелы Apis mellifera. Представленный молекулярно-генетический метод может быть использован в науч- но-исследовательских институтах, лабораториях, селекционно-племенных и матковыводных пасеках, а также в высших учебных заведениях при проведении занятий по пчеловодству, генетике, популяционной биологии и зоологии.

Методические рекомендации рассмотрены и одобрены Ученым советом ВНИИВСГЭ и секцией «Ветеринарная санитария, гигиена и экология отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии» (протокол № 4 от

4 июня 2008 г.).

Рецензент А.Б.Сохликов канд. биол. наук

© Изд-во БГПУ, 2009

2

Введение

Систематика представляет собой тот необходимый раздел биологии, без которого все остальные разделы не имели бы прогностической ценности и оставались бы лишь описательными дисциплинами. Биолог всегда имеет дело с таксонами: если изучает индивидуальные свойства отдельных особей, рассматривает вопросы жизнедеятельности видов в природных и антропогенных экосистемах. Знания о строении, функциях и онтогенеза живых организмов имеют прогностическую ценность только в том случае, если они отнесены к какому-то определенному таксону, а не к некоторым живым существам вообще. Это связано с тем, что все свойства живых организмов приобретены ими в результате неповторимых уникальных эволюционных процессов.

Впоследние годы в связи с нарастанием антропогенной деятельности гибридные формы медоносной пчелы получили широкое распространение внутри естественно сформировавшихся рас (пород) и популяций медоносной пчелы, что повлияло на изменение их адаптивных свойств и морфометрических признаков (Смирнов, Туктаров, 1991). В тоже время бесконтрольная гибридизация среднерусских пчел с «южными», чувствительными к холоду, расами является одной из основных причин гибели и ослабления пчелиных семей в зимне-весенний период и, естественно, одной из важнейших проблем пчеловодства. Ее решение необходимо для перспективных методов ведения селекционных работ и, одним из главных аспектов этого является правильная идентификация систематических рангов медоносной пчелы.

Впрактической деятельности большинство ученых-пчеловодов при изучении рас пчел ограничиваются только несколькими морфометрическими параметрами, чего явно недостаточно для полноценного анализа. Поэтому назрела острая необходимость разработки достаточно четких критериев для внутривидовой систематики медоносной пчелы с использованием современных молекулярно-генетических методов, которые позволяли бы быстро и качественно исследовать внутривидовую изменчивость в условиях сильной гибридизации.

Совершенно новый класс генетических маркеров появился в середине 80-х годов прошлого столетия после открытия полиморфизма ДНК благодаря развитию методов выделения, клонирования и разрезания (рестрикции) генов. На сегодняшний день одним из перспективных направлений в популяционной биологии животных и растений являются разработки с применением метода полимеразой цепной реакции (ПЦР - PCR), позволяющей амплифицировать ничтожные количества ДНК животного и растительного происхождения.

4

1. Общие положения

Митохондриальная ДНК кодирует 13 полипептидов, которые вместе

смногочисленными пептидами, контролируемыми в ядре, образуют митохондриальную электрон-транспортную систему, или дыхательную цепь, функционирующую в митохондриях. Поэтому изменчивость мтДНК может существенно влиять на метаболизм, а значит, и на приспособленность. Функциональная связь между всеми этими белками должна поддерживаться строгим отбором на согласованное взаимодействие митохондриального и ядерного геномов, то есть на коадаптацию ведущим в такой коадаптации должен быть митохондриальный геном, поскольку темп мутирования в мтДНК гораздо выше, чем в ядерной ДНК.

1.1.Митохондриальная дезоксирибононуклеиновая кислота, ДНК (мтДНК) позвоночных относится к повторяющимся, поскольку клетка может содержать сотни митохондрий, а каждая митохондрия – от 2 до 10 копий молекул ДНК. ДНК митохондрий животных – замкнутая кольцевая молекула, величина которой обычно не превышает 20 000 нуклеотидов

(Алтухов, 2003).

У позвоночных животных при определении полной нуклеотидной последовательности мтДНК обнаружены 37 структурных генов и некодирующая контрольная область, участвующая в репликации и называемая D- петлей (Ferris, Berg, 1987). Тандемные повторы мтДНК часто высокополиморфны, варьируя в числе среди особей, а у некоторых организмов даже внутри особи, что является одним из типов так называемой гетероплазмии (Bentzen et al, 1998). Митохондриальная ДНК передается потомству вместе

сцитоплазмой, то есть является гаплоидной и наследуется только по материнской линии.

В силу биологических особенностей медоносной пчелы, в селекционном процессе определяющей является характеристика чистопородности плодных маток, поскольку самцы (трутни) развиваются из неоплодотворенных яиц и несут только тот гаплоидный набор хромосом, который они получили от маток. В этой связи наиболее перспективен поиск маркеров, в наследуемом по материнской линии митохондриальном геноме, нуклеотидная последовательность которого полностью определена.

1.2.Необходимым условием для проведения ПЦР является знание нуклеотидной последовательности амплифицируемой области ДНК, так как специфический выбор этого участка осуществляют путем гибридизации матричной ДНК с двумя искусственно синтезированными праймерами

– олигонуклеотидными последовательностями ДНК длиной обычно от 15 до 30 пар нуклеотидов, комплементарными 31 – концам амплифицируемого участка на смысловой и антисмысловой нитях ДНК.

5

1.3. Успех в разработке метода ПЦР в значительной мере связан с использованием в качестве фермента, обеспечивающего синтез ДНК, термофильной ДНК-полимеразы, выделенной из бактерий, живущих в горячих источниках, и потому устойчивой к действию высоких температур.

2. Основы метода полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Суть методики состоит в том, что в образце, содержащем смесь молекул ДНК (или их фрагментов), двуцепочечные молекулы подвергаются расплавлению (тепловой денатурации). Каждая из цепей служит матрицей, на которой с помощью термостабильной Taq– полимеразы в присутствии олигонуклеотидов, комплементарных к концам данного ДНК-фрагмента (так называемые праймеры), при определенном температурном режиме синтезируется комплементарная последовательность. Иными словами, фермента Taq– полимераза достраивает праймеры, то есть происходит элонгация – синтез нового фрагмента ДНК. ДНК вновь подвергается денатурации, и на одноцепочечные молекулы, как присутствовавшие в растворе изначально, так и синтезированные в предыдущем термоцикле, вновь отжигаются праймеры. Полимераза вновь достраивает их, и процесс амплификации повторяется.

Число молекул ДНК в каждом цикле удваивается и после 30 циклов репликации количество исходной ДНК увеличивается в миллион раз. Метод амплификации ДНК с помощью ПЦР более эффективен, чем метод клонирования, однако последний, в отличие от ПЦР, позволяет оперировать с более крупными фрагментами ДНК – несколько тысяч пар оснований и более (Алтухов, 2003).

2.1. Метод ПЦР, или специфической амплификации ДНК, позволяет избирательно синтезировать in vitro относительно небольшие участки ДНК, длиной от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов (пн), реже до 1000-2000 пн., используя в качестве матрицы любые образцы ДНК, содержащие амплифицируемую последовательность. Принципиальная схема полимеразной цепной реакции выглядит следующим образом: на первом этапе исследуемая двунитевая матричная ДНК переводится в однонитевую форму путем ее нагревания в течение нескольких минут до температуры, превышающей 95-980С. Дальнейшая схема проведения ПЦР заключается в чередовании следующих циклов: гибридизации, или отжи-

га, ДНК с праймерами; синтеза последовательности, комплементарной матричной ДНК; денатурации образовавшихся двунитевых структур.

При гибридизации, достигаемой за счет понижения температуры реакционной смеси до 30-500С, происходит образование двунитевого участка ДНК в строго специфичных областях, комплементарных праймерам. При температуре, оптимальной для работы ДНК-полимеразы, 60-700С, начина-

6

ном геле (1,5 %) с последующим выявлением ампликонов в ультрафиолетовом свете.

3.Приборы и реактивы

3.1.Амплификатор (Терцик с монитором, Церцик) – основной прибор, требующийся для постановки ПЦР. Он позволяет автоматически изменять температуру на основе заданной программы. В термоциклерах пробирки с реакционной смесью помещаются в металлический блок, температура которого изменяется с помощью элемента Пелтье. Он позволяет изменять температуру блока с большой скоростью, что сокращает продолжительность каждого цикла ПЦР. Современные термоциклиры приспособлены для использования специальных тонкостенных пластиковых пробирок, что позволяет ускорить теплообмен между блоком прибора и реакционной смесью и в конечном итоге дополнительно сократить время проведения реакции.

3.2.Камера для горизонтального гель-электрофореза с блокпитанием (Эльф 4).

3.3.Трансиллюминатор (ТМ-36, Vilber Lourmat) – прибор, позволяющий проводить визуальную детекцию результатов ПЦР.

3.4.Центрифуга (MPW-50) для микрообъемов с гнездами под микропробирки «Eppendorf», с регулируемой скоростью вращения до 14000 об/мин и охлаждающей системой.

3.5.Автоматические пипетки переменного объема– отдельно для стоковых растворов и отдельно для работы с пробами, с диапазонами объемов 1….250 мкл.

3.6.Стерильные наконечники для автоматических микропипеток и микропробирки «Eppendorf», емкостью 0,5-1 мл – однократного применения.

3.7.Пробирки для ПЦР.

3.8.Пробирки для выделения ДНК.

3.9.Реактивы:

-10М раствор NaOH;

-2М водный раствор трис-HCl рН 8,0;

-4М гуанидинтиоционат;

-25мМ цитрата натрия;

-100 мМ 2-меркаптоэтанола;

-0,5% саркозил;

-водонасыщенный фенол рН 8,0;

-смесь хлороформ-изоамилового спирта (24:1);

-20-звенные праймеры специфичные для межгенного участка COICOII мт ДНК медоносной пчелы;

8

-50 мМ KCl;

-2,5 мМ MgCl2 ;

-0,01% желатина;

-250 мкмоль dNTP;

-2.5 ед. Taq-полимераза;

-70%-ный этанол;

-бидистиллированная вода;

-вазелиновое масло;

-этидий бромистый.

4.Разработка метода идентификации породной (расовой) принадлежности медоносных пчел Apis mellifera по полиморфным аллелям локу-

са COI-COII мтДНК с применением технологии ПЦР

По нуклеотидному составу мтДНК Apis mellifera отличается высоким содержанием АТ - пар. Участок, расположенный между генами CO-I и COII, за исключением последовательности гена тРНК, сильно отличается по нуклеотидному составу, например, элемент Р - протяженность 54пн, состоит только из АТ - пар, а содержание этих нуклеотидов в Q-элементе

(длине 196пн) составляет 93% (Cornuet, et al., 1991) (рис. 1).

Данное свойство существенно осложняет выбор праймеров для полимеразной цепной реакции в пределах этого участка, поэтому в качестве праймеров были подобраны два олигонуклеотида: CACATTTAGAAATTCCATTA и ATAAATATAAATCATGTGGA, приходящиеся, со-

ответственно, на З΄ и 5΄ - концевые последовательности генов COI и COII. Ожидаемый размер амплифицируемых, с использованием вышеуказанных праймеров, фрагментов мтДНК составляет 350±10пн в случае комбинации Q и 600±10пн при комбинации PQQ (Никоноров и др., 1998).

9

Рисунок 1. Специфический для Apis mellifera вариабельный участок мтДНК (Crozier, Crozier, 1993)

Результаты амплификации мтДНК отдельных особей медоносной пчелы Apis mellifera представлены на рисунке 2.

Размер фрагментов ДНК (пн)

Рисунок 2. ПЦР-анализ со специфичными праймерами (локус COI-COII мтДНК Apis mellifera). М - ДНК фага (маркер), А - среднерусская раса (борть), Б - среднерусская раса (улей), В - кавказская раса (улей)

Как и ожидалось, выявлены различия в размерах амплифицированных фрагментов мтДНК у A.m. mellifera и A.m. caucasica. Они составили 600±10 и 350±10пн., соответственно.

Секвенирование нуклеотидной последовательности амплифицированного фрагмента мтДНК бортевой пчелы башкирской популяции A.m. mellifera показало, что участок состоит из 600пн и включает следующие последовательности: 3΄-конец гена COI - ген тРНКLeu - элемент Р -элемент Q - элемент Q – 5 ΄ конец гена COII. Выявлены определенные замены нуклеотидов в пределах исследуемого участка мтДНК A.m. mellifera по сравнению с ранее опубликованной последовательностью (Cornuet et al, 1991) (рис. 3.).

10