Задание 8. Определение активности липаз

Важными представителями гидролаз, имеющими большое практическое значение, являются липазы, расщепляющие жиры на жирные кислоты и трехатомный спирт глицерин по уравнению:

О

С Н₂О-С +3НОН СН₂О Н R₁ – CООН

R₁

O

СНО С СНОН + R₂ – CООН

R₂

– 3 НОН

O

СН₂О С СН₂ОН R₃ – CООН

R₃

Жирорасщепляющая активность липазы определяется методом титрования свободных жирных кислот, образующихся при гидролизе жира.

Оборудование и реактивы: подсолнечное оливковое) масло: мука, фосфатный буфер рН 7,4: смешивают 800 мг 1/15 М р-р Na₂HPO₄ c 200 мл 1/15 М К₂HPO₄; 0,05 н КОН, смесь спирта с эфиром (1:1), спиртовой р-р фенолфталеина, колбы емкостью 50 мл, пробки, шуттель-аппарат.

Ход работы. В колбу емкостью 30-50 мл отвешивают 3,0 г (с точностью до 0,01 г) подсолнечного масла, 2 мл фосфатного буфера, сильно встряхивают. Затем добавляют 1 г муки и 3 мл воды 20^оС, закрывают плотно пробкой, перемешивают, ставят в шуттель-аппарат и умеренно взбалтывают в течение 1 ч. По истечении этого времени смесь количественно переносят в колбу Эрленмейера, остатки со стенок колбы смывают 60 мл смеси спирта и эфира (1:1). Жирные кислоты, образовавшиеся при гидролизе жира, титруют 0,05 н раствором КОН с 2-3 каплями фенолфталеина. Параллельно ставят контрольный опыт: в колбу насыпают 1 г муки и наливают 3 мл воды, смесь хорошо перемешивают и нагревают 5 мин. на кипящей водяной бане. Затем охлаждают 3 мл масла и далее поступают, как и в рабочем опыте. Активность липазы выражают в мл 0,1 н р-ра щелочи, необходимой для нейтрализации жирных кислот, образующихся при ферментативном гидролизе в 1 г жира. Активность (Х) вычисляют по формуле

Х=

где а-количество р-ра КОН, израсходованного на титрование рабочего опыта, мл;

в-количество р-ра КОН, израсходованного на титрование контрольного опыта, мл;

n- навеска жира, г;

К-поправочный коэффициент к 0,1 н р-ру щелочи.

Липиды Задание 9. Качественные реакции на жиры и масла

Жиры играют большую роль в жизненных функциях живого организма. Они подразделяются на запасные и протоплазматические. Которые являются составной частью протоплазмы клетки, имеют постоянный состав и не расходуются при голодании организма.

Запасные жиры накапливаются в больших количествах в семенах, зародышах и плодах многих растений, которые служат сырьем для получения растительных жиров, называемых маслами. В процессе хранения жиры нередко подвергаются глубоким изменениям, протекающим на воздухе, в присутствии воды и ферментов: это объясняется их сложным химическим сосатавом и содержанием значительного количества непредельных соединений. Растительные масла отличаются большим содержанием ненасыщенных жирных кислот с одной двойной (олеиновой), двумя (линолевой) и тремя (линоленовой) двойными связями. Они весьма неустойчивы при хранении на воздухе, легко окисляются и прогоркают.

Оборудование и реактивы: 1% р-р осмиевой кислоты, краска Судан III, 5 % спиртовой раствор NaОН или КОН, 5% р-р соляной или серной кислоты, кислый сернокислый калий (безводный), воск.

Ход работы. 1. Цветная реакция. Капля масла, смешанная с одной каплей 1% р-ра осмиевой кислоты, дает черное окрашивание, которое указывает на наличие жира в исследуемом объекте:

Масла окрашиваются краской Судан III в различные оттенки красного цвета.

2. Проба на омыление. 3 капли исследуемого масла прибавляют в пробирку к 5 мл 5 % спиртового р-ра щелочи. Смесь нагревают на кипящей водяной бане до испарения спирта. В пробирку прибавляют горячую воду и растворяют мыло. К раствору мыла прибавляют небольшими порциями 5 % р-р соляной или серной кислоты и наблюдают выделение свободных жирных кислот, всплывающих на поверхность жидкости.

3. Акролеиновая проба. Акролеин образуется из глицерина при отнятии от него двух молекул воды водоотнимающим средством, которым является безводный кислый сернокислый калий. Также водоотнимающим средством при образовании акролеина является борная кислота, безводный (кислый сернокислый) калий.

CН₂ОН СН₂

2H₂O

С НОН СН

O

С Н₂ОН С

H

Глицерин Акролеин

3 капли растительного масла нагревают со щепоткой безводного кислого сернокислого калия до появления белых густых паров.

Резкий раздражающий запах указывает на присутствие акролеина. Для сравнения проводят эту реакцию с воском, который не содержит глицерина, а поэтому не наблюдается образования акролеина.