Задание 5. Определение автолитической активности пшеничной муки

Протеазы относятся к группе гидролаз, они катализируют гидролитическое расщепление белковых веществ по месту пептидных связей.

Реакция ферментативного гидролиза белков обратима. Протеазы принято подразделять на протеиназы и пептидазы. Протеиназы ведут гидролиз непосредственно нативных (природных) белков. Это папаин, трипсин, пепсин. При этом следует отметить, что они, кроме гидролиза белков, гидролизуют и различные полипептиды и депептиды. Пептидазы действуют только на пептиды и обладают специфичностью действия. Их действие на субстрат зависит от расположения в нем определенных химических группировок. По характеру своего действия они делятся на аминопептидазы и карбоксипептидазы.

Оборудование и реактивы: пшеничная мука, толуол, 0,1 н р-р NaОН, фенолфталеин – 0,1 %, глицин – 0,25 % р-р, формольная смесь, термостат, фильтр, весы, мерные колбы, конические колбы, пипетки на 2 и 5 мл, бюретка на 10 мл.

Ход работы. К 50 г пшеничной муки приливают 500 мл нейтрализованной воды (рН 7,0) и 0,5 мл толуола. Смесь инкубируют 1 ч при 37^оС в термостате. Во время инкубации смесь тщательно перемешивают. Затем доводят до 1 л, фильтруют и в фильтрате определяют азот аминокислот формольным титрованием. Параллельно ставят контрольный опыт, в котором формольное титрование проводят до инкубирования.

Количество азота аминокислот (Х), образующегося при действии протеолитических ферментов, содержащихся в 100 г исследуемого продукта (мг), определяют по формуле:

Х =

Где а – количество0,1 н раствора NaОН, пошедшее на титрование опыта, мл;

в – количество 0,1 н раствора NaОН, пошедшее на титрование контроля, мл;

V₁ – количество фильтрата, взятого для определения аминного азота;

V – количество полученной болтушки (в мерной колбе), мл;

n – навеска исследуемого материала, г.

Задание 6. Определение активности каталазы муки

Каталаза разлагает перикись водорода по уравнению

2 Н₂О₂ 2Н₂О + О₂

Перекись водорода – ядовитое для клеток вещество; она образуется в окислительно-восстановительном процессе при восстановлении молекулярного кислорода. Каталаза – двухкомпонентный фермент. Одним компонентом его является гематин, который представляет собой окисленную простетическую группу гемоглобина крови. Каталаза парализуется синильной кислотой, сероводородом, фторидами. Количественное определение каталазы основано на учете перекиси водорода путем титрования ее перманганатом калия. Реакция проходит по уравнению

2 КМnO₄+ 5 Н₂О₂ + 4 Н₂SО₄ 2 КН SО₄ + 2 Мn SО₄ + 8 Н₂О + 5 О₂

О количестве перекиси водорода, разрушенной ферментом, судят по разности количества (мл) 0,1 КМnO₄, израсходованного для титрования в контрольном и рабочем опытах.

Оборудование и реактивы: 1 % р-р перекиси водорода, 0,1 н р-р КМnO₄, 10 % р-р Н₂SО₄, мука, аналитические весы, колбы конические, фильтры, колбы мерные на 100 мл, горелки.

Ход работы. Отвешивают на аналитических весах 2 г муки и помещают в мерную колбу на 100 мл. В колбу приливают дистиллированную воду, перемешивают, добавляют 2-3 капли толуола, доводят до метки и смесь настаивают 2 ч при комнатной температуре. После настаивания жидкость отфильтровывают через складчатый фильтр и в фильтре сразу же определяют каталазу. Отбирают четыре пробы прозрачного фильтрата по 20 мл каждая: 2 опытные и две контрольные; последние кипятят 5 мин для инактивации фермента. К опытным и контрольным пробам прибавляют по 20 мл дистиллированной воды, по 3 мл 1 % перикиси водорода, предварительно нейтрализованной 0,1 н раствором NaОН, и сотавляют на 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют по 5 мл 10% серной кислоты и оставшуюся перекись водорода титруют 0,1 н КМnO₄. Об активности каталазы судят по количеству миллиграммов перикиси водорода, которое разрушилось в течение 30 мин ферментом, содержащимся в 1 г исследуемого материала. Активность каталазы определяют по формуле

Ак =

где а – количество 0,1 н КМnO₄, израсходованное для титрования контроля,мл;

в - количество 0,1 н КМnO₄, израсходованное на титрование рабочего опыта, мл (1 мл 0,1 н КМnO₄ эквивалентен 1,7 мг Н₂О₂);

n – навеска исследуемого материала, г.

Пример расчета. Взята навеска муки 2,1675 г. На титрование контроля пошло 12,51 мл КМnO₄, опыта – 9,86 мл. Количество фильтрата (20 мл), взятое для титрования, соответствует 2,1675х20 0,4335 г муки. Подставляем полученные данные в формулу

100

Ак =