21. Опишите метод испытания дистиллированной воды и инъекц р-ров на пирогенность.

Проводится путём введения кроликам (3) в краевую вену уха воды или лс с измерением ректальной т 3 р с интервалом 1 час. При этом строго соблюдаются условия, искл возможность повыш т тела кроликов от случайных причин; Воду или р-р лв считают непирогенным, если после введения ни у 1го из 3 подопытных кроликов ни при 1м из 3х измерений не наблюдалось повыш т более чем на 0,6° по сравнению с исходной т и в сумме повыш т у 3 кроликов не превышало 1,4°. Если у 1го или 2 кроликов т повысилась более чем на 0,6° и в сумме у 3 кроликов повыш т составляет более 1,4° , испытание повтор дополнит на 5 кроликах; воду или р-р считают непирогенными, если не более чем 3 всех 8 кроликов наблюдалось индивидуальное повыш т на 0,6° и более и общая сумма повыш т у всех 8 крол не превышала 3,7°.

22. Исследование лекарственного средства, не стерилизуемого в процессе производства. Количественное определение бактерий и грибов: изобразите в виде схемы.

В отношении лс, не стерилизуемых в процессе производства, проводится испытание на микробиологич чистоту. Это испытание вкл в себя колич-ное определение жизнеспособных бак и грибов, а также выявление опред видов микроорг, наличие кот недопустимо в нестерильных лс.

Испытание проводят в асептических условиях. Лс, обладающие антимикробным д-вием, и консерванты, вход в состав некот лс, могут подавлять рост отдельных видов микроорг при проведении испытаний. Во избежание неправильной оценки результатов испытания опред д-вие лс в отношении тест-микробов. Для испытания антимикробного д-вия лс, не стерилизуемого в процессе производства, применяют тест-микробы: B.subtilis, B.cereus, E.coli, S.aureus, Salmonella abony, Candida albicans, Aspergillus. Предварительно готовят разведения лс: 1:10, 1:50, 1:100, 1:500, 1:1000. В пробирки с пит средами вносят по 1 мл каждого разведения, в контрол пробирки – по 1 мл стерильной дистил воды. Затем во все пробирки вносят по 0,1 мл микробной взвеси тест-штамма. При обнаруж антимикробн д-вия лс устраняют его и после этого производят посев на микробиол чистоту. При отсут антимикробного д-вия производят прямой посев.

Колич-ное опред бак и грибов проводят 2хслойным агаровым методом в чашках Петри.

Опред общего числа бак. Испытуемый р-р вносят по 1 мл в каждую из 2 пробирок с 4 мл расплавл и охлаждённого до 45-50°С МПА. Быстро перемешивают содержимое каждой пробирки и переносят в чашку Петри, содержащую 15-20 мл застывшего агара. Быстрым, осторожным покачиванием чашки Петри равномерно распределяют верхний слой агара. После застывания среды чашки Петри переворачивают и инкубируют в теч 5 сут при 30-35ºС. Через 48 ч и окончат через 5 сут подсчит кол-во бактериал колоний на 2 чашках, вычисляют ср значение и т о находят число бак в 1 мл образца.

Опред общего числа грибов. Испытание проводят 2хслойным агаровым методом, испол плотную среду Сабуро. Инкубируют посевы при 20-25ºС. Через 72 ч и окончательно через 5 сут подсчитывают общее число колоний дрожжевых и плесневых грибов на 2 чашках, находят среднее значение.

Выявление и идентификация видов микроорг, наличие кот недопустимо в нестерильных лс: бак сем Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus.

23. Идентификация микробов – контаминантов лекарственных средств. Кажите признаки, по которым идентифицируют Pseudomonas aeruginosa.

Образец в кол-ве 10 мл вносят в 100 мл среды обогащения, перемешивают и инкубируют при 30-35°С в теч 24-48 ч. При наличии роста пересевают на чашку со средой для выявления пиоцианина и на чашку среды с маннитом. После инкубации в термостате отбирают подозрительные колонии.

Идентифицируют Pseudomonas aeruginosa по морфологии (грам- неспорообразующие палочки), по специфич запаху и сине-зелёному пигменту, наличию фермента цитохромоксидазы. Staphylococcus aureus идентифицируют по морфологии (грам+ кокки), по сбраживанию маннита в анаэробных условиях, по реакции плазмокоагуляции.

24. Идентификация микробов – контаминантов лекарственных средств. Кажите признаки, по которым идентифицируют Staphylococcus areus.

Выявл и идентификация Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus. Образец в кол-ве 10 мл вносят в 100 мл среды обогащения, перемешивают и инкубируют при 30-35ºС в теч 24-48 ч. При наличии роста пересевают на чашку со средой для выявления пиоцианина и на чашку среды с маннитом. После инкубации в термостате отбирают подозрительные колонии. Идентифицируют Pseudomonas aeruginosa по морфологии (грам- неспорообразующие палочки), по специфич запаху и сине-зелёному пигменту, наличию фермента цитохромоксидазы. Staphylococcus aureus идентифиц по морфологии (грам+ кокки), по сбраживанию маннита в анаэробных условиях, по р-ции плазмокоагуляции.

25. Идентификация микробов – контаминантов лекарственных средств. Кажите признаки, по которым идентифицируют Salmonella.

Испытание на виды Salmonella проводят путём высевания из среды обогащения на чашки с висмут-сульфит агаром. На этой среде Salmonella образуют чёрные колонии с металлич блеском, при этом участок среды под колонией прокрашивается в чёрный. Подозрительные колонии микроскопируют, отсевают на среду Олькеницкого и ставят тест на цитохромоксидазу. Если в образце обнаружены грам- неспорообразующие палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидазой, не ферментирующие сахарозу и лактозу и выделяющие сероводород, считают, что лс контаминировано (заражено) бактериями рода Salmonella.

26. Идентификация микробов – контаминантов лекарственных средств. Кажите признаки, по которым идентифицируют Escherichia coli.

Испытание на Escherichia coli проводят путём высева из среды обогащения на чашку со средой Эндо. Подозрительные колонии красного цвета микроскопируют и при наличии грам- палочек делают пересев в пробирке с цитратным агаром Симмонса, на кот опред утилизацию цитрата натрия по изменению цвета среды с зелёного на синий. Наличие индола опред путём посева в пит бульон. Если в образце обнаружены грам- неспорообразующие палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидазой, не утилизирующие цитрат натрия и образующие индол, считают, что лс контаминировано Escherichia coli.

27. Идентификация микробов- контаминантов лекарственных средств. Количественное определение энтеробактерий (кроме Сальмонелл и Эшерихии). Укажите, в каком объеме препарата обнаружены энтеробактерии

10 мл испытуемого образца помещают в 100 мл среды № 11, гомогенизируют и инкубируют при т 32.5 + 2.5°С в течение 2х ч, но не более 5. В случае, если л с - суппозитории или р-ры в маслах, в среду № 11 добавляют стерильный Твин-80 в кол-ве не более 5% и стеклянные бусы для эмульгирования. Гомогенат перемешивают и готовят разведения 1:10 и 1:100, используя для этого среду № 3. В 3 пробирки с 10 мл среды № 3 вносят 1 мл гомогената в 1ую, 1 мл разведения 1:10 во 2ую и 1 мл разведения 1:100 в 3ю, т е соответственно 0.1 г, 0.01 г, 0.00 1 г образца. Посевы инкубируют при т (32.5 + 2.5)°С в течение 24-48 ч. При наличии роста делают пересев петлей на плотную среду № 4 (агар Эндо) и инкубируют чашки Петри при той же т в течение 18-24 ч. В случае появления характерных для Enterobacteriaceae колоний грам- палочек опред кол-во энтеробактерий в 1 г или в 1 мл образца

28. Определение активности антибиотика в отношении тест-микроба методом серийных разведений. По результатам посева определите МИК (минимальную ингибирующую концентрацию)

Серийный метод титрования м б выполнен в разных объемах среды (от 1 до 10 мл). Эксперименты

выпол в асептичных условиях при испол стерильных пипеток для каждого ингредиента р-ции. Титрование можно проводить в плот и жид средах. При титровании в жид средах в ряд пробирок наливают пит среду в строго опред объеме. Кол-во пробирок опред кол-вом разведений препарата, кот необходимо взять в опыт. B 1ю пробирку вносят опред кол-во р-ра а\б, перемешивают, затем опред объем смеси из 1й пробирки переносят во 2ю, перемешивают и переносят то же кол-во смеси из 2-й в 3-ю и т. д. Из последней пробирки, содерж а\б, такой же объем смеси выливают, чтобы во всех пробирках объем жидкости был одинаков. Пробирка, не содержащая а\б, явл контрол. После этого во все пробирки, содержащие серийно разведенный а\б, и в контрол пробирку вносят одинаковое кол-во взвеси тест-культуры. Штатив с пробирками встряхивают и ставят в термостат при 37°C на 18 -20 ч. Кратность разведения а\б обычно выбират равной 2м, для этого в каждую пробирку наливают, н, по 1 мл бульона, в 1-ю пробирку вносят 1 мл р-ра а/б и переносят из пробирки в пробирку по 1 мл смеси. При этом точность опред активности препарата составляет ±5%. Точность опред можно повысить путем дополнит разведений а\б, н используя кратности 1:1,1;1 : 1,15; 1 : 1,20 и т. д. Взвесь кл тест-культуры готовят на изотонич р-ре хлорида натрия при обязательном сравнении со стандартами мутности. При титровании антибактериальных а\б микробная нагрузка обычно составляет 2,5•105 микробных кл на 1 мл р-ра а\б в пит бульоне. Для этого готовят взвесь тест-культуры по стандарту 10 ед. мутности, что составляет 1 млрд микробных тел в 1 мл. Взвесь разводят изотонич р-ром до концентр 2,5-106 кл в 1 мл и вносят в пробирки с серийно разведенным а\б по 0,1 мл на 1 мл пит бульона. При испол в кач-ве тест-культуры дрожжей микробная нагрузка составляет 4-106 кл в 1 мл. метод серийных разведений в плот средах отличается тем преимуществом, что микробы-загрязнители при этом легко выявляются и по существу не изменяют общих результатов титрования, тогда как на жидких средах весь опыт может оказаться безрезультатным.