14. Общая характ вирусов, методов их культивирования, их идентификации.

Вирусы – неклет форма жизни. Занимают промежуточное положение между живой и неживой материей, т.к. совмещают в себе признаки живых организмов и неживой природы. Являются внутриклеточными паразитами. Основ св-ва вирусов: 1)Ультрамикроскопические размеры.

2)Вирусы содержат нуклеин к-ту только 1го типа — или ДНК, или РНК. Все др организмы содержат нуклеин к-ты обоих типов, а геном у них предст только ДНК.

3)Вирусы не способны к росту и бинарному делению. 4)Вирусы размножаются путем воспроизводства себя из собственной геномной нуклеин к-ты. Размножение всех прочих организмов вкл стадии бинарного деления кл. 5)У вирусов отсут собственные сис-мы мобилизации энергии. 6)У вирусов нет собственных белоксинтезирующих систем.

7)В связи с отсут собственных сис-м синтеза белка и мобилизации энергии вирусы явл абсолютн внутриклет паразитами. Средой обитания вирусов явл бактерии, кл раст, животных и человека.

Размеры вирусов: -мелкие от 20 до 70нм -средние от 80 до 150нм -крупные от 150 и более

Для опред размеров вирусных частиц испол: фильтрование вируссодержащего материала через мембраны, ультрацентрифугирование, электрофорез, электронную микроскопию.

Фильтрование через коллодиевые мембраны. Метод основан на пропускании вируссодержащего материала через мембраны с известным размером пор. Размер вирусн частицы в данном случае опред весьма приблизительно.

Осаждение при ультрацентрифугировании. Многие способы опред размеров вирионов основаны на анализе скорости их движения в суспендирующей жидкости. Частицы, взвешенные в жидкости, оседают с разной скоростью, благодаря чему компоненты взвеси можно быстро разделить центрифугированием. Скорость осаждения частицы прямо пропорциональна разности плотности частиц и жидкости, квадрату угловой скорости и квадрату радиуса окружности и обратно пропорциональна вязкости жидкости. Скорость осаждения зависит от формы оседающих частиц.

Прямое исслед в электрон микроскопе. Электрон микроскопия – наиб широко примен метод опред размеров вирусных частиц. Для этого увеличение на электронных микрофотографиях д б откалибровано с испол внутреннего маркера.

Сформированная вирусн частица, находящ вне кл, назв «вирион». Вирион явл внеклет формой существования вируса.

В центре вириона располаг нуклеин к-та (вирусн геном). Снаружи нуклеин к-та покрыта белковой оболочкой - капсидом (лат. capsa – футляр, коробка). Капсид как чехлом окружает вирусн нуклеин к-ту. Вирусн геном и капсид вместе образуют нуклеокапсид. Капсид состоит из повторяющихся морфологических субъединиц - капсомеров. Простые вирусы м б как РНК-содержащими, так и ДНК-содержащими. У сложных вирусов наряду с капсидом имеется дополнит оболочка - суперкапсид (пеплос, покрывало). Суперкапсид состоит из двойного слоя липидов и специфич вирусных белков. Суперкапсидная оболочка вируса явл модифицированной цитоплазматической мембраной кл, в кот репродуцировался данный вирус. На поверхности некот оболочечных вирусов располаг шипы или шипики (пепломеры, суперкапсидные белки) - это липопротеиновые или гликопротеиновые выступы.

I гр - вирусы, имеющие спиральный тип симметрии. II гр - вирусы, имеющие кубический тип симметрии. III гр - вирусы, имеющие комбинированный (смешанный, сложный) тип симметрии.

Выделяют след формы вирионов по морфологии: - палочковидная форма характерна для вируса табачной мозаики; - пулевидная форма присуща вирусу бешенства; - сферическая форма отмечается у многих вирусов, в частности у герпесвирусов, вируса иммунодефицита чела; - нитевидная форма наблюдается у филовирусов; - овальная форма характерна для вируса натурал оспы; - сперматозоидная форма отмечается у бол-ва вирусов бактерий (бактериофагов)

В зависимости от вида нуклеин к-ты различают РНК - (рибовирусы) и ДНК - (дезоксивирусы) содержащие вирусы. Вирусы, паразитирующие в кл животных и чела, содержат ДНК или РНК; паразитирующие в кл растений – лишь ДНК. В зависимости от структуры и хим состава оболочки вирусы делят на простые и сложные. - прост вирусы (просто устроенные, безоболочечные, “голые”), сост из нуклеин к-ты и 1ой белковой оболочки - капсида;

- слож вирусы (сложно устроенные, оболочечные, “одетые”), содержащие кроме нуклеин к-ты и капсида внешнюю липопротеиновую оболочку (суперкапсид)

Культивирование вирусов. Вирусы – облигатные внутриклет паразиты. Они размножаются в живых кл и не растут на искусствен пит средах, поэтому методы культивирования вирусов отличаются от методов культивирования бактерий.

Методы культивирования. 1. На лаб животных. Заражают животных (п/к, в/м, внутрибрюшино), кот чувствительны к опред вирусам: хорьков - вирусом гриппа, кроликов - вирусом бешенства, обезьян - вирусом полиомиелита.

Индикация (обнаруж) вируса проводится по признакам заб. Недостаток - не все вирусы можно культивировать на животных, напр, животные невосприимчивы к вирусам человека.

2. В кур эмбрионах. Заражают кур эмбрион (аллонтоисная полость, хорион-аллонтоисная оболочка, амниотическая полость, желточный мешок, сам эмбрион). Кур эмбрион – очень удобен. Он защищен от попадания др микробов (стерильный), техника работы с ним проста, можно накопить большое кол-во вирусов. Индикация: а) по специфич поражениям на хорион-аллантоисной оболочке, по гибели эмбриона, б) по р-ции склеивания эритроцитов – р-ции гемагглютинации (РГА). Недостатки: а) не все вирусы (вирус полиомиелита, вирус ящура) можно вырастить в кур эмбрионах; б) невозможно обнаружить микроб без вскрытия эмбриона; в) в нем много загрязняющих белков и др соед.

3. В ткан культурах. Ткан культуры или клет культуры – кл, выращенные вне организма на искусственных пит средах. Для их приготовления испол чаще всего эмбриональные и опухолевые тк. Метод ткан культур разработан Дж. Эндерсом в 50-е г. Бол-во вирусов способно размножаться в культурах кл. Для каждого вируса можно подобрать наиб чувствительную культуру кл. Бывают культуры растущих тк и переживающих тк (утративших способность к росту). Существуют 3 типа растущих ткан культур: а) однослой ткан культуры – кл прикрепляются и растут в виде сплошного монослоя по поверхности стекла лаб посуды;

б) культуры суспензированных кл – кл растут и размножаются во взвешенном состоянии;

в) органные культуры - кусочки органов животных и чела, выращиваемые вне орг. Однослой культуры – основ культуры.

Различают: а) первич – кл этой культуры делятся 1 раз, поэтому каждый раз необходимо вновь получать культуру тк; чаще всего испол эмбриональные тк и опухолевые тк взрослого чела;

б) полуперевиваемые – кл делятся до 50 раз, сохр диплоидный набор хромосом; их можно перевивать несколько раз; испол диплоидные кл чела (фибробласты человеч эмбриона, диплоидные кл легких чела);

в) перевиваемые – кл культуры постоянно делятся в условиях in vitro (вне орг), поэтому их можно перевивать непрерывно; их готовят из линий кл, кот хорошо размножаются в течение многих лет; чаще всего эти культуры получают из опухолевых кл. Получено около 200 штаммов таких кл: штамм L (из культуры мышиных фибробластов), штамм HeLa (из карциномы шейки матки), штамм Hep-3 (из лимфоидной карциномы) и т.д. Первич и перевиваемые линии клет культур м б загрязнены неизвестными вирусами, в т ч онкогенными, это ограничивает их применение, особенно в производстве вак. Все работы с культурами кл требуют строжайшего соблюдения правил асептики. К культуре кл добавляют а/б против бактериал загрязнения.

Опред вида и типа вирусов в вируссодержащем материале производится путём нейтрализации вирусов специфич сыворотками. Результат нейтрализации м б установлен на основании след признаков: 1) нейтрализация ЦПД; 2) нейтрализация гемадсорбции; 3) задержка (торможение) гемагглютинации; 4) цветная проба; 5) свечение кл, содержащих вирус, под влиянием специфич флюоресцирующих сывороток; 6) нейтрализация в опыте на животных (у опытных животных инфекция не развивается).

Вирусы гриппа относятся к семейству Orthomyxoviridae (греч. orthos - правильный, прямой; myxa - слизь) и представляют собой РНК-содержащие сложные (оболочечные) вирусы.

Диаметр частицы вируса гриппа составляет 80-120 нм. Вирион имеет сферическую форму.

Вирионы содержат 1% РНК, 70% белка, 24% липидов и 5% углеводов. Липиды и углеводы входят в состав суперкапсида и имеют клет происхождение. Геном вирусов гриппа представлен односпиральной линейной фрагментированной (сегментированной) минус-РНК. В геноме вирусов гриппа А и В имеется по 8 фрагментов, в геноме вируса гриппа С - 7 фрагментов. Каждый фрагмент генома кодирует информацию об 1ом или двух белках

Каждый фрагмент генома покрыт отдельным белком (капсидом). Все фрагменты в совокупности покрыты белковой оболочкой, образуя нуклеокапсид. Нуклеокапсид вирусов гриппа имеет спиральный тип симметрии. Геном вируса гриппа А кодирует след основные белки: - структурные белки – гемагглютинин (H), нейраминидаза (N), мембранные белки М1 и М2, нуклеопротеин (NP), белки полимеразного комплекса (компоненты вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы - белки PB1 - транскриптаза, PA - репликаза, PB2 - эндонуклеаза), минорный белок NEP (бывший белок NS2); - неструктурный белок – белок NS1.

Вирусы гриппа имеют поверхностные и внутр антигены. К поверхностным антигенам относятся гемагглютинин и нейраминидаза. Эти антигены определяют тип вируса. Антитела именно к этим антигенам выполняют защитную ф-цию от проникающих в организм вирусов гриппа.

К внутр антигенам относятся нуклеопротеин (белок NР) и М-белки. Антитела к внутр антигенам не оказывают защитного эффекта. Структура гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа типа А постоянно изменяется. В наст вр известно 16 подтипов гемагглютинина и 9 подтипов нейраминидазы. От чела выделяются подтипы гемагглютининаН1, Н2 и Н3 и подтипы нейраминидазы N1 и N2. Необычайная изменчивость вирусов гриппа типа А объясняется антигенным дрейфом и антигенным шифтом.

Гемагглютинин (Н) предст собой шип в виде тримера, состоящего из идентичных субъединиц. Каждая из 3х субъединиц в свою очередь состоит из 2х цепей – тяжелой и легкой. Гемагглютинин взаимодействует с клет рецептором (сиаловой к-той), способствует проникновению вируса в кл путем слияния суперкапсидной оболочки с клет мембраной и раздеванию вируса. У вируса гриппа выявлено 16 вариантов гемагглютинина (от Н1 до Н16).

Нейраминидаза (N) предст собой грибоподобный тетрамер. Его 4 сферических субъединицы прикреплены к ножке, кот заякорена в суперкапсидной оболочке вируса. Нейраминидаза способствует как проникновению 9 вируса через богатые сиаловой к-той секреты слиз оболочек для достижения кл-мишеней, так и высвобождению дочерних вирусных частиц из кл. При проникновении внутрь кл нейраминидаза распознает рецепторы, содержащие N-ацетилнейраминовую (сиаловую) к-ту. У вируса гриппа А выявлено 9 вариантов нейраминидазы (от N1 до N9).