Биоинженерия / Polioxialkanoaty_POA__biorazrushaemye_polimery_dlya_meditsiny

практически одинаковы у различных микроорганизмов (Alcaligenes, Azotobacter, Pseudomonas) (рис. 2.2).

Условия, обеспечивающие изменение направления анаболизма клеток с белковой программы в сторону синтеза и аккумуляции полиоксибутирата, определяются окислительно-восстановительным состоянием цитоплазмы, внутриклеточной концентрацией пирувата и свобод-

ного КоА (Oeding and Schlegel, 1973; Senior and Dawes, 1973). При оп-

тимальных условиях роста пируват, а также восстановительные эквиваленты в виде НАДН и НАДФН расходуются в основном в цикле трикарбоновых кислот на образование аминокислот, а также преобразование энергии в клетке, при этом сохраняется высокий уровень сво-

Рис. 2.2. Обобщенная схема синтеза ПОА у R. еutrophа

1 – β-кетотиолаза; 2 – НАДФН-зависимая ацетоацетил-КоА редуктаза; 3 – ПОА-синтаза; 4 – НАДН-зависимая ацетоацетил-КоА редуктаза (Braunegg et al., 1998).

60

бодного КоА, что является препятствием для синтеза ПОБ. При несбалансированном росте, например при отсутствии азота в среде или дефиците кислорода, пируват не включается в цикл трикарбоновых кислот, а подвергается карбоксилированию с образованием ацетил-КоА, уровень свободного КоА при этом низок, что является благоприятным условием для активизации ферментов цикла ПОБ.

Полиоксибутират и другие ПОА ассоциируются в клеточной цитоплазме в виде включений (гранул); предложенная модель их фор-

мирования (Gerngross, Martin, 1995) показана на рис. 2.3.

Прежде всего, растворимая ПОБ-полимераза (синтаза) взаимодействует с возрастающими концентрациями 3-оксибутирил-КоA в цитоплазме, приводя к праймингу фермента. По мере роста длины цепи олигомеры далее формируются в мицеллы. Мицеллоподобные

Рис. 2.3.

А. Сходство между ПОБ полимеразой и липазой. ПОБ-полимераза (ПОБ-П) действует на поверхности гранулы ПОБ, где происходит полимеризация растворимых предшественников, которые собираются в гидрофобной области на поверхности гранулы. ПОБдеполимераза (ПОБ-Д) также действует на поверхности, высвобождая мономеры из полимера. Обе эти реакции сходны с реакциями, катализируемыми липазами (L), которые гидролизуют эфирные связи триглицеридов (ТГ) на границе раздела фаз вода/триглицериды.

В. Предполагаемый механизм образования гранул ПОБ. Растворимый фермент конвертирует мономер КоА в олигомеры, которые остаются связанными с ферментом (этап 1). При критической длине олигомера и концентрации комплекса «фермент-олигомер» образуются мицеллы (этап 2). Мицеллы постепенно укрупняются и приобретают форму гранул (этап 3). С ростом числа гранул происходит их слияние, что приводит к образованию крупных агрегатов ПОБ (этап 4).

61

частицы дают границу раздела фаз с полимеразой, расположенной внутри. Фермент затем быстро продолжает ПОБ синтез, вытесняя большее количество ПОБ в возрастающую гранулу. Авторами установлено также, что минимальные условия, необходимые для активации синтеза ПОБ, заключаются в наличии 3-гидоксибутирил-КоA как субстрата и ПОБ-полимеразы.

В последующих исследованиях было показано, что с увеличением размеров гранул в анализируемых пробах возрастает количество белка независимо от того, является ли этот белок ПОБ-поли- меразой или несвязанным белком типа сывороточного альбумина

(Martin, Gerngross, 1996). Белок, кодированный phaP геном, опреде-

ляющий размер ПОА гранул, был идентифицирован в генетических исследованиях R. eutropha. Иммунохимический анализ с антителами показал, что этот белок всегда связан с гранулами и не присутствует в цитоплазме дикого типа в свободном виде. Характеристики phaP связанных белков напоминают таковые олеозинов, – белков, которые связываются исключительно с жировыми телами, выполняя структурную роль и предотвращая сращивание тел. По этой причине, рhaР-подобные белки обычно упоминаются как фазины. К настоящему времени организующая роль белков, связанных с гранулами полимера, показана и для других полимерсинтезирующих микроорганизмов (Stuart et al., 1998; Valentin et al., 1998; Fuller and Clinton, 1999).

Деполимеразы, вызывающие деструкцию полимера, синтезируются микроорганизмами как внутриклеточно, так и внеклеточно. Внутриклеточная деградация ПОБ исследована не так детально, как синтез и внеклеточная деградация полимера, хотя этот процесс может играть решающую роль для физиологии бактерий, продукции полимера в клетке, его качественного состава. Гидролиз полимера осуществляется последовательно ферментами ПОА-деполимеразой, (Д)-оксибутират дегидрогеназой и ацетоацетил-КоА-синтазой (кетотиолазой) (Doi, 1990). Продуктом деградации ПОБ являются мономеры, димеры и короткоцепочечные полимеры Д(-)-3-гидроксибути- рата в соотношении 80–85 %, 15–20 % и следовых количествах, соответственно. Димеры и мономеры Д(-)-3-гидроксибутирата, образованные на первом этапе деградации ПОБ, гидролизуются под действием димер-гидролаз (эстераз) до мономеров. Гидролаза не проявляет активности в отношении других эфиров, а также нативных гранул ПОБ или очищенного ПОБ и ингибируется диизопропилфторфосфатом. Мономеры 3-гидроксибутирата превращаются под действием НАД-зависимой гидроксибутиратдегидрогеназы в ацетоацетат. Ацетоацетат вступает в трансферазную реакцию с сукцинил-КоА, катализируемую тиофоразой (ацетоацетат: сукцинил-КоА КоАтрансфераза), в результате которой образуется ацетоацетил-КоА

62

(Saito et al., 1995; 1996). Под действием кетотиолазы ацетоацетилКоА превращается в ацетил-КоА, который поступает на энергетические и анаболические нужды клетки.

2.4. Генетика внутриклеточной системы синтеза ПОА

Начиная со второй половины 80-х годов, исследования по проблеме микробиологического синтеза полиоксиалканоатов начали существенно обогащаться работами по молекулярной генетике микроорганизмов, синтезирующих ПОА. Биосинтетический путь образование полиоксибутирата, как было показано, представлен тремя реакциями, которые катализируются тремя ферментами (рис. 2.4). Первый фермент – кетотиолаза – кодируется геном phbA; второй – редуктаза – геном phbB; и третий – полимераза – геном phbC.

Во второй половине 80-х годов была создана библиотека генов Z. ramigera и клонирована в E. coli. С помощью анти-тиолазных антител был выделен ген phbА и было показано, что phbА и phbВ образуют один оперон, а phbС локализуется на другом участке хромосомы (Peoples, Sinskey, 1989 a, b). Практически одновременно с этими работами были клонированы и охарактеризованы гены синтеза ПОБ из R. eutropha (Schübert et al., 1988). Было показано, что гены 3-

кетотиолазы (phbА), ацетил-КоА редуктазы (phbВ), ПОА синтазы (phbС) образуют один оперон с промотором, оператором и структурными генами (Schübert et al., 1991). Установлено, что три фермента синтеза ПОА кодируются в следующем порядке – синтаза, тиолаза и редуктаза (Peaples, Sinskey, 1989b). Синтез ПОА контролируется на уровне транскрипции (Slater et al., 1988). Недавно были выделены, секвенированы три гена синтеза ПОБ из A. latus и и экспрессированы в E. coli (Genser et al., 1998). Результаты секвенирования свидетельствуют о высокой гомологии (71–80 %) этих генов с генами R. eutropha, идентичности ориентации и организации соответствующих оперонов. Существенные отличия выявлены только в структуре и активности промотора, которая значительно выше в A. latus. На основании этих результатов авторы предполагают общность происхождения генов, ответственных за синтез ПОБ, у A. latus и R. eutropha.

Рис. 2.4. Организация оперона синтеза ПОА у A. eutrophus (Peoples, Sinskey, 1989; Steinbüchel et al., 1992)

63

К настоящему времени клонировано 42 структурных гена ПОА синтазы из 38 различных микроорганизмов, относящих к различным физиологическим группам. Для 30 генов определена нуклеотидная последовательность, что должно помочь в дальнейшем в понимании функционировании этого фермента (Rehm, Steinbüchel, 1999).

Структура оперонов, ответственных за синтез ПОА, из различных организмов существенно отличается по расположению генов. Так, в

Acinetobacter spp., Pseudomonas acidophila, подобно вышеописанным

A. latus и R. eutropha, гены phbСАB образуют один оперон, хотя порядок их расположения может отличаться (Peaples, Sinskey, 1989; Umeda et al., 1998; Madison, Huisman, 1999). В Paracoccus dinitrificans,

Rhizobium meliloty and Z. ramigera локусы phbАB и phbС генов не связа-

ны (Tombolini et al., 1995; Ueda et al., 1996; Peoples, Sinskey, 1989). ПОА полимераза из Chromatium vinosum, Thiocystis violacea, Synechocystis

представлена двумя субъединицами и кодируется двумя генами phbЕ и phbС. В этих организмах phbАB и phbЕС гены находятся в одном локусе, но имеют дивергентную ориентацию (Hein et al., 1997; Liebergesell,

Steinbüchel, 1992;1993). В Methylobacterium extorquens, Nocardia corallina, Rhizobium etli, Rodococcus ruber, Rodobacter sphaeroides был идентифицирован только ген ПОА полимеразы (Сevallos et al., 1996; Hall et al., 1998; Hustede, Steinbüchel, 1993; Pieper, Steinbüchel, 1992;

Valentin, Steinbüchel, 1993). Полимеразный ген у Aeromonas caviae соседствует с phbJ геном, участвующим в синтезе мономеров ПОА (Fucui, Doi, 1997). В продуцентах средне- и длинноцепочечных ПОА (P. oleovorans и P. Aeruginosa) содержатся два phаС гена, разделенных геном phbZ, кодирующим внутриклеточную ПОА деполимеразу. Две полимеразы, как оказалось, идентичны на 50–60 % по первичной структуре и обладают очень близкой субстратной специфичностью

(Huijberts et al., 1992; Huisman et al., 1991; Timm, Steinbüchel, 1992).

Данные по разнообразию структуры генома, кодирующего систему синтеза ПОА, дают почву для некоторых рассуждений по поводу ее эволюции. Когда бактерии впервые приобрели способность синтезировать полимер, то, вероятнее всего, он не играл роль запасного материала. Образование ПОА было, возможно, минорным метаболическим путем у этих организмов и результатом какой-либо побочной реакции. Когда синтез полимера стал физиологически значимым для микробов, вероятно, произошла селекция штаммов, аккумулирующих ПОА под воздействием определенных условий, которые в настоящее время неизвестны. Знание этих условий могут быть чрезвычайно полезными для оптимизации процессов получения ПОА рекомбинантными организмами. В процессе эволюции ген, кодирующий фермент ПОА-синтазу, комбинировался с генами, ответственными за синтез мономеров, или с генами, включенными в другие реакции ПОА метаболизма, например phbZ. В результате селекции в

64

ПОВ у A. eutrophus на разных углеродных субстратах (Doi et al., 1990). Клетки, содержащие 55 % ПОБ от абсолютно сухого вещества клетки, выращивали на пентановой кислоте в условиях азотного лимита. В течение 96 часов гомополимер был заменен сополимером, содержащим 44 мол. % бутирата и 56 мол. % валерата. После пересева клеток в среду, содержащую бутират, уровень оксивалерата в полимере упал с 56 % до 19 %. Эти результаты авторы объясняют тем, что в клетках одновременно идет синтез и деградация полимера. Это позволяет перестраивать состав полимера в зависимости от подаваемого углеродного субстрата. Циклический процесс ПОА метаболизма можно проиллюстрировать схемой (рис. 2.5) из работы (Doi et al., 1990). Аналогичная модель цикличности внутриклеточного процесса синтеза и деградации ПОБ предложена для Azospirillum brasilense (Tal et al., 1990).

Однако изучение обмена ПОБ у водородных бактерий, выращиваемых в условиях непрерывной культуры на среде с высоким соотношением С/N и с добавлением меченой глюкозы, показали, что радиоактивность в биомассе и в полимере падает с одинаковой скоростью. Авторы считают, что в течении роста не происходит существенного обмена ПОБ, а активность деполимеразы или очень низкая, или не проявляется совсем (Haywood et al., 1989).

2.5. Продуценты полиоксиалканоатов

Список микроорганизмов, способных с теми или иными выходами внутриклеточно аккумулировать полиоксибутират или продукты сополимеризации ПОБ с другими оксипроизводными жирных кислот, быстро пополняется. К настоящему времени он насчитывает свыше

300 организмов (Anderson, Dawes, 1990; Steinbüchel, Valentin, 1995; Braunegg et al., 1998; Madison, Huisman, 1999). Среди описанных ор-

ганизмов – аэробные и анаэробные бактерии, гетеротрофы, хемооргано- и хемотрофы, фототрофные прокариоты. (Azotobater, Alcaligenes, метанотрофы Bacillus, Nocardia, Methylobacter, Pseudomonas, Rhizobium, Zoogloea); аэробные фотобактерии (Chloroglaea, Chloroflexus); олиготрофные полипростековые бактерии (Labrys, Prosthecomicrobium, Stelle), архебактерии (Haloferax), анаэробные фототроф-

ные бактерии (Chromatium, Rhodosperillum) и другие.

Несмотря на имеющееся разнообразие изученных микроорганизмов, аккумулирующих ПОА, для промышленного использования рассматривается очень небольшое число продуцентов. Среди них – хемоорганотрофный организм Ralstonia (до недавнего времени известный как Alcaligenes), способный использовать различные источники углерода и гетеротрофные микроорганизмы, относящиеся к трем таксонам – Methylotrophus, Methylobacterium и Pseudomonas

66

(Anderson, Dawes, 1990; Lee, 1996; Choi, Lee, 1997; 1999; Steinbüchel,

Valentin, 1995; Braunegg et al., 1998; Madison, Huisman, 1999).

В качестве критериев для выбора потенциального продуцента полиоксиалканоатов принято рассматривать следующие показатели: химический состав (по соотношению С-мономеров, в % к полимеру), выход полимера (в % по отношению к весу абсолютно сухого вещества клетки), затраты углеродного субстрата (ед. веса/ед. веса ПОА), концентрацию биомассы клеток в культуре (вес/ед.объема), продуктивность процесса (ед. веса ПОА/ед. объема культуры/ед. времени). Результаты продукции полиоксиалканоатов наиболее перспективными продуцентами представлены в таблице 2.3.

Таблица 2.3 Образование полиоксиалканоатов различными микроорганизмами

(Lee et al., 1996b)

67

2.5.1. Природные штаммы – продуценты ПОА

Первыми в 70-х гг. существенный коммерческий интерес вызвали метилотрофные микроорганизмы в связи с доступностью и относительно низкой ценой метанола.

Принципиальная возможность использования метанола в качестве углеродного субстрата для получения полиоксиалканоатов была продемонстрирована на примере различных микроорганизмов:

Protomonas, Methylobacterium, мутантных штаммов Ralstonia eutropha, а также Pseudomonas denitrificans. Так, Methylobacterium extorquens, выделенный из почвы, синтезирует гомогенный полиоксибутират и его сополимеры с валератом (Bourque et al., 1992), соответственно, на метаноле и смесях метанола с валератом. В режиме с подпиткой субстратом на комплексном азотном источнике (с добавками рыбного экстракта), при контролируемой ЭВМ подаче метанола в культуру, скорость образования ПОА достигает 1.7 г/л ч; включение валерата в полимер может составлять до 20 мол. %. Другой изолят, M. extorquens sp. KCTC0048, помимо сополимеров 3-ПОБ-со-3-ПОВ, способен аккумулировать сополимеры 3-ПОБ-со-4-ПОБ при различном соотношении фракций 3-ПОВ и 4-ПОБ (Kang et al., 1993). К продукции ПОБ на метаноле при лимитировании роста азотом, а также магнием или фосфатом, способен факультативный метилотроф

Pseudomonas 135 (Daniel et al., 1992); мутантный штамм R. eutropha,

аккумулирующий ПОБ и ПОБ-со-ПОВ в периодической культуре при лимите азота (Alderete et al., 1993; Park, Damodaran, 1994), в т. ч. на средах с этанолом и пропанолом.

Детальное изучение метилотрофных организмов показало, что они не отвечают всем необходимым критериям, так как выходы полимера у метилотрофов недостаточно высокие (50–60 % к АСБ), а синтезируемый полимер характеризуется низкой молекулярной массой (40 000–60 000 Da). Затраты субстрата на образование полимера высоки (экономический коэффициент образования ПОА на мета-

ноле, Y, г/г, 0.18–0.20).

Azotobacter был следующим микроорганизмом, рассматриваемым в качестве потенциального продуцента ПОА. Интересен в этом плане организм Azotobacter vinelandii UW, синтезирующий полиоксибутират на доступных углеродных субстратах (Page, Knops, 1989). Обнаружив очень низкий уровень НАДН оксидазной активности в выделенном организме, авторы связали эту особенность со способностью организма эффективно синтезировать полиоксибутират с высоким выходом (до 65–75 % к сухому веществу клетки) во время экспоненциального роста, посчитав, что процесс синтеза ПОБ есть один из путей, в котором возможно восстановление НАД. Далее было показано, что синтез ПОБ связан с азотфиксацией (Page, 1992; Page, Cornish, 1993). Авторы показали, что при азотфиксации в штамме

68

UWD во время истощения азота в ассимиляционных условиях этот процесс зависит от полиоксибутирата, так как последний обеспечивает энергией реакцию нитрогеназы. Добавки в среду рыбного пептона в качестве комплексного источника азота стимулируют высокую скорость синтеза ПОБ на фоне высокого урожая биомассы. Штамм также способен утилизировать мелассу, а при индуцирующих добавках пропионата накапливает сополимеры 3-ПОБ-со-3-ПОВ. Максимум продукции полимера при этом составляет до 1 г/л в час. При росте на среде с валератом в качестве единственного источника углерода уровень 3-ПОВ в полимере достигает 45 мол. %. Однако процесс синтеза полиоксиалканоатов в азотобактере не стабилен и сопровождается накоплением в клетках полисахаридов, что затрудняет процедуру экстракции полимера и отражается на его свойствах. Ряд штаммов Azotobacter beijerinckii рассматривают в качестве потенциальных продуцентов ПОА на средах с мелассой, продуктах гидролиза кукурузы и т. п. Возможности оптимизации процесса позволяют надеяться на достаточно продуктивный процесс синтеза полимера при оптимальной концентрации мелассы, равной 65.4 г/л

(Purushothaman et al., 2001).

Третьими организмами, вызвавшими интерес, в частности ICI, были хемоорганотрофные водородные бактерии Ralstonia (Alcaligenes), которые синтезировали высокомолекулярный полимер с высокими выходами (до 80 % и выше), используя в качестве источника углерода при автотрофном росте диоксид углерода (в смеси с водородом), а при гетеротрофном – фруктозу. В результате был реализован первый крупномасштабный процесс получения полиоксибутирата на фруктозе при стерильной ферментации в аппарате объемом 200 000 л (Byron, 1987).

Бактерии, относящиеся к таксону Ralstonia eutrophа, синтезируют полиоксиалканоаты с высокими выходами на минимальной солевой среде при нормальном рН и 30 С, используя в качестве источника углерода углекислоту, а также разнообразную органику, однако из сахаров – только фруктозу. Усиление скорости синтеза ПОА начинается в конце линейной фазы роста бактерий в условиях периодической культуры по мере снижения скорости синтеза белка и достигает максимума на стационарной фазе. Происходит это у R. eutrophus при так называемом несбалансированном росте, лимитированном одним из элементов минерального питания (азотом, фосфором, серой и др.). Выходы ПОА, длительность ферментационного цикла на различных субстратах при различных режимах выращивания и продуктивность процесса варьируют в широких пределах, соответственно,

70–87 %, 60–120 час, 0.3–2.42 г/л/час (Byron, 1992; 1994).

В литературе описано много штаммов данного микробного вида. Наиболее изученными и используемыми в качестве продуцента

69