Биоинженерия / Polioxialkanoaty_POA__biorazrushaemye_polimery_dlya_meditsiny

Таблица 6.2 Санитарно-химические исследования вытяжек шовных нитей из ПОА

при различных значения рН исходной воды (Севастьянов с соавт., 2001)

В ходе культивирования фибробластов мыши линии NIH 3T3 на полимерных пленках, независимо от их состава, клетки сохраняли морфологию, характерную для нормальных клеток, выращиваемых в контроле на стекле. Оценка жизнеспособности клеток при помощи метода прижизненного окрашивания трипановым синим показала, что 99.8 ± 0.2 % клеток, культивируемых на полимерных пленках из ПОБ и ПОБ-со-ПОВ (содержание оксивалерата от 4 до 30 мол. %) не включали краситель, то есть сохраняли высокую жизнеспособность в отличие от взятого для сравнения полиэтилена. Культивирование фибробластов на полимерных пленках в течение трех суток не влияло на синтез белка в культуре. Время удвоения фибробластов, культивируемых при прямом контакте на полимерных пленках всех типов соответствовало времени генерации клеток, культивируемых в контроле на стекле, и составляло 25 ± 2 ч. (Шишацкая с соавт., 2001).

Далее под руководством доктора биологических наук Н. А. Сеткова было исследовано влияние пленочных образцов ПОА на синтез ДНК в клетках in vitro, стимулированных к пролиферации (Шишацкая с соавт., 2001) (рис. 6.1), так как такие клетки наиболее чувствительны к повреждающим воздействиям цитотоксических факторов (Епифанова с соавт, 1983). Были взяты фибробласты мыши NIH 3Т3, относящиеся к минимально трансформированным клеточным линиям, а также первичные культуры паренхимных (гепатоциты) и непаренхимных (главным образом, эндотелиальных) клеток печени мыши. Выбор культур обусловлен следующим: фибробласты непосредственно участвуют в процессах воспаления и инкапсулирования любых инородных включений, а клетки печени, помимо детоксикационной функции, обладают повышенной, по сравнению с другими клетками, чувствительностью к воздействию цитотоксических факторов.

210

Культуру покоящихся фибробластов линии NIH 3Т3 получали по стандартной методике. Стимуляцию пролиферативной активности клеток проводили путем смены среды на свежую, содержащую 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Гепатоциты выделяли с помощью нерециркуляционной двухэтапной (неэнзиматической и энзиматической) перфузии печени наркотизированных мышей по методу Дудиной-Барковской и Миттельмана. Клетки NIH 3Т3 культивировали на среде DМЕМ с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (НПО «Вектор», Новосибирск), 1.0 мМ L-глют- амина, 10 мМ HEPES буфера и 100 мкг/мл канамицина сульфата (BDSL, UK). Гепатоциты ресуспендировали в смеси сред

DMEM+NCTC-135 (1:1) (BDSL, UK), содержащей 5 % инактивирован-

ной при 56°C ЭТС; 0.1 % глюкозы; 0.2 % сывороточного альбумина для клеточных культур; 0,5 мкг/мл инсулина; 50 нг/мл дексаметазона; 0.2 мкг/мл глюкагона (Sigma, США); 0,02 мМ β-меркаптоэтанола; 10 мМ HEPES буфера и 100 мкг/мл канамицина сульфата. Эндотелиальные клетки ресуспендировали в среде Ham´s F12 (BDSL, UK) c добавлением 10 % ЭТС, в которой наращивали их количество, проводя 2–3 пассажа с помощью 0.2 % раствора коллагеназы, разбавленного 0,02 % раствором версена.

Клетки высевали в пенициллиновые флаконы (по 5 флаконов на каждую экспериментальную точку), содержащие пленки изПОА и в качестве контроля – стекло; объем среды составлял в 2 мл с добавлением 3Н-тимидина (37 кБк/мл; 92,5 ГБк/мМ). Исходная концентрация фибробластов и эндотелиальных клеток составляла по 30 000, гепатоцитов – 50 000 в 1 мл. Культивирование проводили в течение 16 ч. в гумидной атмосфере с 5 % CO2 с периодическим отбором клеток для исследований.

В ходе культивирования клеток в среде с 10 % эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС) на поверхности мембран из ПОБ и ПОБ- со-ПОВ не обнаружено снижения включения 3Н-тимидина ядрами всех типов клеток, стимулированных к пролиферации, по сравнению с контролем (стекло). Следовательно, прямой контакт клеток с поверхностью мембран из ПОА обоих типов не приводил к подавлению синтеза ДНК и не ингибировал клетки.

Культивирование фибробластов и гепатоцитов в течение трех суток при прямом контакте с поверхностью мембран из ПОБ и ПОБ-со-ПОВ не влияло на время генерации клеток и синтез белка. Эти результаты свидетельствуют о том, что очищенные образцы полиоксибутирата, а также сополимеров оксибутирата с оксивалератом, не оказывали токсического воздействия не только на морфологию и рост клеток, но и на синтез белка, а также активность матричных процессов.

212

Физико-механические свойства и степень биосовместимости изделий на их основе определяются не только структурой и базовыми физико-химическими свойствами исходного полимерного материала, но в существенной степени зависят от чистоты образцов и способа получения изделий (Williams et al., 1999). Когда в работе (Чапут с соавт., 1995; Chaput et al.,1995a, b) исследовали цитотоксичность ПОБ- со-ПОВ в культуре фибробластов, культивируемых при прямом контакте с полимером и на агаре с добавлением водных экстрактов ПОА, было установлено, что не только увеличение доли оксивалерата (от 7 до 22 мол. %) вызывает незначительный цитотоксический эффект, но также и условия получения экстрактов (температура, длительность экстракции и др.). В серии работ Cаада с соавторами показано, что пористые DegraPol® – хороший материал для роста животных клеток разных типов (Saad et al., 1996;1997a,b). Вместе с тем, при увеличении концентрации частиц материала в среде и их размеров (от 1 до 20 мкм) клетки разных типов в различной степени снижали скорость роста и продукцию метаболитов, например, коллагена, фибронектина и др. (Saad et al., 1999). Существенное влияние на адгезию и рост клеток оказывает структура поверхности полимерных изделий. В этой связи значимыми являются результаты работы (Rouxhet et al., 1998), в которой было исследовано влияние модификации поверхности полимерных пленок различными белками на адгезию и пролиферацию мононуклеарных макрофагов. Авторы установили, что модификация поверхности полимерных пленок фибронектином в отличие от альбумина или коллагена улучшает адгезию клеток оказывает. Есть сведения о том, что при обработке поверхности пленок и мембран из полиоксиалканоатов, например, лазерной резкой (Lootz et al., 2001), плазмой при низком давлении (Nitschke et al., 2002), а также ферментативно (липазами) или химическим гидролизом (NaOH (Yang et al., 2002), влияющими на пористость и гидрофильность пленок, значительно улучшаются функциональные характеристики изделий, повышается адгезия и рост клеток.

В отношении других типов ПОА пока данные весьма ограниченны. Недавно показано, что поверхность пленок из сополимера оксиоктаноата и оксигексаноата обладает хорошими адгезионными свойствами по отношению к животным клеткам (Stock et al., 1998). Хорошие адгезионные свойства пленок, изготовленных из сополимера оксибутирата и оксигексаноата (ПОБ-со-ПОГ), по отношению к фибробластам мыши показаны в работе (Yang et al., 2002). Авторы отметили, что клетки росли на таких пленках лучше, чем на полилактидных или изготовленных из полиоксибутирата.

Как было отмечено в Главе 1, все большую значимость при создании биоискусственных органов и тканей приобретают пористые пленочные и трехмерные матриксы на основе биодеградируемых

213

Рис. 6.2. Стволовые клетки костного мозга крысы линии Вистар на поверхности ПОБ-cо-ПОВ включение оксивалерата 15 мол. %). Время культивирования клеток

– 9 дней. Увеличение 200 (неопубликованные данные В. И. Севастьянова).

биополимеров. Рисунок 6.2 иллюстрирует положительный результат применения для культивирования клеток пленочного матрикса «ЭластоПОБ» (ЗАО «Биомир-сервис», Москва), изготовленного из разработанной в НИИ трансплантологии и искусственных органов композиции на основе сополимера ПОБ-со-ПОВ (Институт биофизики СО РАН), высокомолекулярного гидрофильного пластификатора и порообразователя. При культивировании стволовых клеток костного мозга крысы линии Vistar (лаборатория стволовых клеток НИИ трансплантологии и искусственных органов), оказалось, что клетки хорошо прикрепляются с последующей пролиферацией на поверхность полимерных мембран, и их рост сопоставим с контролем на полистирольных планшетах.

6.2. Гемосовместимые свойства ПОА

Одной из ключевых задач применительно к новым биоматериалам является доказательство их абсолютной безвредности для организма. Особые требования, как известно, предъявляются к биоматериалам, предназначенным для длительного контакта с кровью, так как гемосовместимость является наиболее важным аспектом биологической совместимости. Гемосовместимые материалы при контакте с кровью не должны вызывать тромбозов, тромбоэмболий, антигенного ответа, деструкции форменных элементов крови и белков плазмы (Биосовместимость, 1999). Индикатором гемосовместимости биоматериалов служит состояние системы гемостаза (Севастьянов с соавт., 1987; Zinner et al., 1998), которое можно оценить по таким показателям, как морфология адгезированных тромбоцитов (Васин с соавт., 1998), активация комплемента (Sevastianov and Tseytlina, 1984), высвобождению моноцитами цитокинина (Zinner et al., 1997) и

214

др. В отношении полиоксиалканоатов, вопрос о гемовосметимости должным образом в литературе не освещен.

В работе В. И. Севастьянова с сотрудниками (Севастьянов с соавт., 2001; Sevastianov et al., 2003) выполнено исследование возможности получения образцов ПОА, пригодных для контакта с кровью, и предпринята попытка идентификации примесей, способных активировать системы гемостаза (Sevastianov et al., 2002). Результаты исследования гемосовместимых свойств полимерных пленок, полученных из ПОБ и ПОБ-со-ПОВ, включающие определение относительного количества и морфологии адгезированных на поверхности полимерных пленок тромбоцитов, активации свертывающей системы крови и системы комплемента, представлена на рис. 6.3–6.7 и таблицах 6.3–6.6.

Количество и морфология тромбоцитов, адгезированных на поверхности пленок из ПОБ и ПОБ-со-ПОВ, изучена методом сканирующей электронной микроскопии. По степени морфологических изменений адгезированные тромбоциты были разбиты на четыре класса (рис. 6.3). Основными параметрами для характеристики процесса взаимодействия тромбоцитов с поверхностью материала служили:

1)общее количество тромбоцитов, адгезированных на поверхность исследуемого материала (относительно контрольного материала);

2)количество клеток каждого из указанных выше классов (относительно контрольного материала); 3) морфология одиночных клеток. Для каждого образца суммировали количество клеток по всем полям и вычисляли относительный показатель адгезированных тромбоцитов (ОПАТ) по формуле

ОПАТ = No6p/NКОНТР,

и N КОНТР. – количество клеток на образце и контроле (полиэтилене, ПЭ), соответственно. Значения ОПАТ вычисляют и для каждого класса тромбоцитов ОПАТi (i = 1, 2, 3, 4).

Рис. 6.3. СЕМ фотографии адгезированных клеток на пленках из полиэтилена низкого давление:

1 – неактивированные клетки (не деформированные) без признаков распластывания и псевдоподий; 2 – клетки с псевдоподиями

(активированные тромбоциты с явно выраженными псевдоподиями); 3 – полностью распластанные тромбоциты;

4 – агрегаты (Sevaianov, 2002).

215

Существенных различий в морфологии адгезированных тромбоцитов на поверхности пленок из образцов гомогенного ПОБ, а также из сополимеров оксибутирата с оксивалератом не обнаружено (рис. 6.4). Результаты количественного анализа адгезии тромбоцитов на поверхности полимерных пленок (вычисленные значения ОПАТi для каждого из полимеров) представлены на рис. 6.5.

Суммарное количество клеток, адгезированных на поверхности ПОБ, сопоставимо с контролем и несколько ниже на образцах ПОБ-со- ПОВ. В целом количество неактивированных тромбоцитов в 1.5–1.7 раза выше на пленках из ПОА обоих типов, по сравнению с контролем

– ПЕ (полиэтилен низкого давления). При этом доля распластанных клеток также существенно ниже на поверхности пленок ПОБ и ПОБ-со- ПОВ по сравнению с контрольным полиэтиленом. Количество агрегатов убывало с увеличением содержания гидроксивалерата в полимере.

Рис. 6.4. Характерная картина тромбоцитов, адгезированных на поверхности пленок из ПОА

(Sevastianov et al., 2003).

Рис. 6.5. Значения ОПАТi для четырех классов тромбоцитов, адгезированных на поверхности полимерных пленок из ПОБ, ПОБВ и ПE (контроль):

1 – неактивированные клетки;

2 – клетки с псевдоподиями;

3 – полностью распластанные тромбоциты; 4 – агрегаты; 5 – сумма клеток

(Севастьянов с соавт., 2001).

216

Из полученных данных следует, что все исследуемые образцы ПОА обладают хорошей гемосовместимостью на стадии клеточного ответа (реакции тромбоцитов на чужеродную поверхность). По данному показателю сополимерный материал более пригоден для контакта с тромбоцитами. В целом, поверхность полимерных пленок из ПОА оказывала на тромбоциты меньшее активирующее воздействие, чем использованный в качестве контроля полиэтилен низкого давления.

Данные по активации свертывающей системы крови, индуцированной поверхностью ПОА-пленок (в значениях относительного времени рекальцификации плазмы) и системы комплемента (в значениях абсолютной (kинд)обр и относительной (Кинд) констант скоростей, суммированы в таблицах 6.3–6.4.

Для образцов из ПОБ-со-ПОВ время рекальцификации было сопоставимо с реакцией плазмы, однако для полиоксибутирата выявлено значительное превышение показателя, которое по величине сопоставимо с гепаринизированными материалами (Севастьянов с соавт., 1987). По-видимому, использованная технология очистки полимеров не исключает присутствие в образцах примеси биологически активные веществ, например липополисахаридов клеточных стенок грам-отрицательных бактерий (ЛПС), которые способны ингибировать каскадный путь активации свертывания крови.

Таблица 6.3 Абсолютные (ВРП) и относительные (ОВРП) значения времени

рекальцификации плазмы для образцов ПОА (Севастьянов с соавт., 2001)

Таблица 6.4 Значения абсолютной (kинд)обр и относительной (Кинд) констант скоростей

активации системы комплемента, индуцированной поверхностью ПОА (Севастьянов с соавт., 2001)

217

Предположение о наличии в образцах ПОА биологически активных веществ за счет остаточных концентраций макромолекул бактериальных клеток подтвердилось обнаруженным комплементактивирующим действием полимеров (таблица 6.4). Все тестируемые образцы показали высокую активирующую способность относительно системы комплемента, существенно превышающую пороговое значение константы скорости активации системы комплемента (1.5). Наибольшее значение Кинд получено для ПОБ, наименьшее – для ПОБ-со-ПОВ с 18 мол. % оксивалерата.

Эти результаты свидетельствуют о негативном воздействии поверхности пленок из ПОА на ферментные системы крови. Возник вопрос, в результате какого фактора это происходит? Имеет ли место активация ферментных систем крови собственно полимерным материалом или нежелательные реакции есть следствие воздействия биологически активных веществ биомассы бактерий, присутствующих в образцах?

С целью поиска причины эффекта активации ферментных систем крови ПОА проведен детальный анализ химического состава образцов. В материале не обнаружено посторонних примесей белковой и углеводной природы, даже в следовых количествах. Учитывая это, а также принадлежность продуцента к грамотрицательным прокариотам, поиск был сосредоточен на компонентах мембран липидной природы. Известно, что образцы ПОА, синтезированные грам-отрицательными бактериями, после выделения из биомассы могут содержать в своем составе эндотоксины ЛПС, которые вызывают воспалительные, пирогенные и другие реакции (Martin and Williams, 2002). На примере двух продуцентов (природного штамма R. eutrophua и рекомбинантного штамма E. сoli) показано, что в зависимости от способа экстракции уровень эндотоксинов в полимере можно существенно снизить, до 20 U/g и менее. Это позволяет получать образцы материала, пригодные для медицинских приложений с допустимым уровнем эндотоксинов

(Lee at al., 1999).

Компонентом липидной составляющей ЛПС грам-отрицательных бактерий является липид А, в составе которого обнаружены -гидр- оксикислоты с длиной цепи от 12 до 18 атомов углерода, а также ряд насыщенных жирных кислот (ЖК) (Ritschel et al.,1988; Raitz et al.,

1991). В связи с тем, что спектр ЖК ЛПС достаточно специфичен для отдельных групп бактерий, воздействие эндотоксина на организм может быть различным. Поэтому была предпринята попытка обнаружения в исследуемых образцах полимеров эндотоксинов бактериального происхождения по составу жирных кислот.

В работе (Sevastianov et al., 2003) установлено, что жирнокислотный состав ЛПС исследуемого в данной работе продуцента ПОА

218

– бактерий R. eutropha B5786, характеризуется высоким содержани-

ем насыщенных С14:0 (более 20 мол. %), С16:0 (10 мол. %) и -гидр- оксикислот, представленных -ОН-С14:0 (> 50мол. %), -ОН-С12:0

(0.2 мол. %), -ОН-С16:0(0.2 мол. %), -ОН-С18:0 (0.5 мол. %).

Действительно, в тестируемых образцах ПОА методом хрома- то-масс-спектрометрии было выявлено присутствие длинноцепочечных ЖК. Суммарная концентрация жирных кислот в полимере составляла от десятых долей до единиц (2–3) мол. %. При

этом до 70 % этой величины приходилось на долю кислоты С16:0. Из длинноцепочечных гидроксикислот обнаружена только -ОН-С14:0,

доля которой не превышала 0.06 мол. % (рис. 6.6). Эти данные могут свидетельствовать о присутствии в образцах ПОА эндотоксинов клеточной стенки бактерий.

В этой связи используемая схема экстракции полимеров из бактериальной биомассы и очистки была модифицирована. В технологическую цепь включена дополнительная процедура перерастворения полимера в хлороформе с последующей экстракцией и дополнительной очисткой. Это позволило получить образцы полимеров, не содержащие длинноцепочечных ЖК (рис. 6.7).

Результаты последующего тестирования очищенных образцов полимеров (с 15 мол. % оксивалерата), не содержащих микропримесей насыщенных и длинноцепочечных гидроксикислот, представлены в таблицах 6.5–6.6.

Рис. 6.6. Хроматограмма образца ПОБ-со-ПОВ (соотношение мономеров С4:С5 = 79.19:18.12 мол. %) суммарное содержание примеси оксикислот С6–С18

2.67 мол. % (Sevastianov et al., 2003).

219