Биоинженерия / Polioxialkanoaty_POA__biorazrushaemye_polimery_dlya_meditsiny

Пленочные и объемные конструкции были получены из полиоксибутирата и сополимеров оксибутирата с оксигексаноатом с при-

менением «salt leaching techniques» (Zhao et al., 2003). В ходе полу-

чения таких конструкций авторы варьировали плотность растворов полимеров, используемых для получения пленок и объемных матриц, а также соотношение компонентов в смеси «ПОБ-ПОБ-со- ПОГ». В результате были получены изделия, различающиеся структурой и свойствам, главным образом, температурными характеристиками и кристалличностью и, следовательно, различающиеся по прочности и эластичности Наиболее удачные объемные конструкции (scaffolds), полученные из композита двух полимеров, содержащие 60 % ПОБ-со-ПОГ, испытаны в эксперименте с культивируемыми in vitro клетками. Использовали первичную культуру хондроцитов, которые выделяли из 3-5 дневных кроликов. Культурой клеток засевали scaffolds и анализировали адгезию, рост клеток, формирования монослоя, а также синтез и выделение остеокальцина

(рис. 4.12).

Рис. 4.12. Хондроциты, выращиваемые на матрицах из ПОБ-со-ПОГ: А – исходная матрица без клеток; Б – полимерная матрица с

растущими хондроцитами. Видны сферические клетки, вросшие в полимерную матрицу из ПОБ-со-ПОГ

(Zhao et al., 2003).

180

Клетки хондроцитов нормально росли на такой подложке и формировали костно-подобный слой, в котором соотношение кальция и фосфора соответствовало таковым в нормальной костной ткани. В следующем эксперименте подложки были имплантированы крысам линии Вистар на длительный срок. Все это время конструкции сохраняли прочностные характеристики. На сроке 26 недель отмечена выраженная деструкция полимерной матрицы, в основном, за счет аморфной фазы. В целом, продемонстрированы высокие фи- зико-механические и медико-биологический свойства конструкции и пригодность для реконструктивной хирургии костных тканей.

Впоследнее время для восстановительной хирургии костных тканей достаточно широкое развитие получили работы по получению композиционных материалов и scaffolds на их основе с использованием ПОА и гидроксиапатита Описаны успешные примеры получения пленочных и объемных конструкций ПОА с гидроксиапатитом и антибиотиками для заживления поврежденных костей, а также лечения хронических костных инфекций (Doyle et al., 1991; Lukinska and Bonfield, 1997 ; et al.).

Полиоксиалканоаты в чистом виде, а также в сочетании с полилактидами и другими материалами смешивают с трифосфатом кальция. Далее из такого композита формуются объемные или пленочные изделия, которые засеваются клетками. В зависимости от типа смешиваемых компонентов, молекулярного веса и условий формования получают конструкции различной структуры (плотные или пористые). Стандартными термомеханическими методами получают композиты на основе трифосфата кальция и полиоксибутирата,

вслучае же использования композитов ПОА с хитином используют растворные технологии. Пример таких технологий успешно иллюстрируется одной из работ этого направления (Wang et al., 2001). Авторы получили биоактивные биодеградируемые композиты, используя ПОА в смеси с гидроксиапатитом и хитином в сравнении с композитами хитина с полилактидом. Анализировали структуру и свойства полученных конструкций и характер развития на их основе клеток in vitro. В ходе экспериментов наблюдали процесс образование костеподобных кристаллов на поверхности и внутри данных конструкций. В композите ПОА/хитин происходит образование кристаллов минерала в виде островков спустя 28 дней (рис. 4.13a, а нормальный минеральный слой образуется через 72 дня (рис. 4.13б)

Вэкспериментах in vitro показано, что включение частиц биокерамики в биоразрушающиеся полимеры позволяет получать биоактивные композиты с улучшенными свойствами, например, обладающие стимулирующим эффектом по отношению к остеобластам. Постепенная биодеградация полимерного матрикса в таких конструкциях способствует проникновению в них размножающихся клеток и

181

С целью определения устойчивости полимерных пленок к воздействию стерилизующих агентов исследовано влияние термических и химических методов стерилизации на физико-механические свойства (Шишацкая с соавт., 2001). Пленки стерилизовали термообработкой (в сухожарочном шкафу в течение 24 ч. при 120° и 140°С, автоклавированием при 120°С в течение 45 мин. (1.1 атм), облучением γ-источником (доза 2.5 Мрад) и выдерживанием в дезинфицирующих растворах (96 % этанол (24 ч.) и 6 % перекиси водорода (6 ч.) (рис. 4.14).

Существенных различий влияния способа стерилизации на величину молекулярной массы полимерного материала не выявлено, однако прочностные свойства пленок из ПОБ после автоклавирования и суховоздушной термообработки при 140°С несколько ухудшались. Пленки, изготовленные из ПОБ, при этом становились хрупкими. Отмечено некоторое (менее 20 %) снижение прочности. Негативного влияния исследованных способов стерилизации на аналогичные свойства пленок, изготовленных из ПОБ-со-ПОВ, не обнаружено. Результаты изучения влияния стерилизации на свойства поверхности полимерных пленок представлены в таблице 4.7.

Шовные нити, изготовленные из двух типов ПОА, стерилизовали паровым способом (автоклавированием в течение 45 мин. при 120 (1.1 атм) и 130°С (2.0 атм) и γ-облучением (доза 2.5 Мрад). Оба метода практически не влияли на прочностные свойства нитей, изготовленных из ПОБ-со-ПОВ. Зарегистрированные незначительные изменения показателей прочности ПОБ-нитей (абсолютная разрывная нагрузка и модуль упругости) в пределах 10 % от исходных значений находятся в пределах точности применяемых методов измерений (таблица 4.9). Отметим, что Европейская Фармакопея допускает падение прочности хирургических нитей после стерилизации на 25 %.

А Б

Рис. 4.14. Топография поверхности пленок, изготовленных из ПОБ (А) и ПОБ-со-ПОВ (Б): 1 – исходная, 2 – обработка этанолом, 3 – сухожаровая стерилизация,

4 – автоклавирование (Шишацкая с соавт., 2001).

183

Глава 5. БИОДЕГРАДАЦИЯ ПОЛИОКСИАЛКАНОАТОВ

Способность полиоксиалканоатов разрушаться до конечных продуктов (аэробно, до СО2 и Н2О) в различных биологических средах является одним из наиболее ценных их свойств (Jendrossek et all., 1990; Brandl et al., 1990; Abe et al., 1995; 1998; 2000; Abe, Doi, 1996;1999; Doi, Abe, 1997; Jendrossek, 2001).

Полиоксиалканоаты могут разрушаться не только под воздействием температуры, но в результате кислотного и щелочного гидролиза, а также под биологическим путем, под воздействием ферментов – деполимераз. При термальном разложении происходит случайное разделение полимера (Grassie and Murray,1984). Под влиянием кислот или щелочей полиоксиалканоаты разлагаются, как обычные эфиры. Гидролиз ПОБ сильной кислотой (например, 3N НСl) при 104.5 показал, что кислота атакует эфирные соединения кристаллизованной оболочки, но не кристаллизованного ядра ПОБ гранул. (Yu et all., 2000). В разбавленных растворах процесс химического гидролиза полиоксиалканоатов протекает крайне медленно, но увеличивается при высоких температурах (Mergaert, 1993). Биологическая деградация ПОА происходит гидролитически под воздействием специфических ферментов-деполимераз, продуцируемых микроорганизмами, а также ферментами крови и тканей высших животных

(Doi et al., 1992 a,b; Gogolewski et al. , 1993a, b; Abe and Doi, 1996; Abe et al., 1998;).

5.1. Биодеградация ПОА в модельных и природных средах

Наиболее изучаемым аспектом биодеградации ПОА является способность микроорганизмов использовать данные полимеры в качестве субстрата для роста. Микроорганизмы разрушают ПОА внутри клеток эндодеполимеразами и внеклеточно – под воздействием внеклеточных деполимераз (Jendrossek et all., 1996). Микробные ПОА-деполимеразы относят к сериновым эстеразам (Brucato, Wong, 1991; Müller, Jendrosek, 1993).

Внутриклеточные деполимеразы ПОА не гидролизуют полукристаллические полиоксиалканоаты, выделенные из биомассы, а внеклеточные деполимеразы не обладают субстратной специфичностью по отношению к полимеру, ассоциированному в гранулах внутри клеток. Это связано с различным фазовым состоянием и различиями в

186

структуре внутриклеточного «нативного» и внеклеточного «денатурированного» из гранул полимера (Jendrossek et all., 1996).

При внеклеточной деградации полимера продукт гидролиза поглощается микроорганизмами, утилизируется в виде разложенных на составные части соединений в качестве источников питания. Экзодеполимеразы многих бактерий, а также грибов выделены в чистом виде и охарактеризованы. К их общим свойствам следует отнести следующее: а) стабильность при изменяющихся условиях pH, температуры и ионной силы среды; б) относительно низкую молекулярную массу (менее 100 кДа); в) большинство деполимераз состоит только из одного полипептида; г) ПОА-деполимеразы не связываются с анионами таких веществ как ДЕАЕ (нейтральная pH), но близки по свойствам к гидрофобным материалам; д) оптимум pH для них составляет 7.5-9.8,(исключение составляют экзодеполимеразы P. pickettii и P.funiculosum, имеющие оптимум рН, соответственно, 5.5 и 6.0) большинство PHA деполимераз подавляются ингибиторами сериновых гидролаз, такими как диизопропилфлуорофосфат или ацилсульфаниловыми соединениями, которые ковалентно связываются с активным участком серина у сериновых гидролаз (Jendrossek et all., 1996).

Показано, что процесс энзиматической деградации пленок из ПОБ на 2–3 порядка выше, чем обычная небиологическая гидролитическая деградация в водных средах (Kumagai, 1992a, b). Факторами, наиболее воздействующими на биоразрушаемость, являются стереоконфигурация, степень кристалличности и молекулярная масса данных полимеров, а также химический состав (Kanewasa et all., 1994; Abe et al., 1998). Установлено, что между длиной углеродной цепи ПОА и ее разрушением существует прямая связь (Quinteros et all., 1999). При изучении пленочных образцов было показано, что ПОАэкзодеполимераза в первую очередь гидролизует полимерные цепи в аморфной фазе и только после этого затрагивает упорядо-

ченные зоны (Organ, Barham, 1988; Doi et al., 1989b; 1992a; Hocking et al., 1996). В целом процесс энзиматической деградации полимера в аморфном состоянии примерно в 20 раз превышает деградацию цепей кристаллического строения ( Abe et all., 1995).

Сотрудники под руководством профессора Дои, проводящие широкие исследования в области биосинтеза и изучения структуры и свойств различных по составу ПОА, предположили, что ферментный гидролиз полиоксиалканоатов имеет двухступенчатый характер. Сначала происходит адсорбция деполимеразы на полимере и далее начинается его гидролиз (Doi et all., 1994; Kasuya et all; 1995).

Продуктами, образуемыми в ходе энзиматической деполимеризации ПОА, могут быть мономеры (например, у Comamonas sp., Al.eutrophus), димеры (P.fluorescens) или смесь олигомеров, от мономеров до тримеров (A. faecalis и P. lemoignei). Олигомеры затем

187

разрушаются до мономеров олигомерными гидролазами (Abe et all.,

1999; Jendrossek et all., 1996; Shirahura et all., 1986)

Возможны два места энзиматической атаки фермента при взаимодействии с упорядоченной фазой ПОА. В первом случае размер кристалла уменьшается от грани по направлению к центру. Фермент последовательно деградирует индивидуальные цепи вдоль гранул кристалла, начиная от доступного конца цепи (Urmeneta et all., 1995; Yu et all., 2000). В другом случае деградация цепей основана на разделении цепи. Вначале атака инициирует складки цепей и затем продолжается перпендикулярно ламелярному слою до тех пор пока не достигнет плотного ламелярного центра, после этого процесс останавливается. Существует мнение, что отдельные кристаллы атакуются от конца кристалла предпочтительнее, чем от складки по-

верхности (Urmeneta et all., 1995).

Бактериальная деградация различных типов полиоксиалканоа-

тов Comamonas sp., Pseudomonas lemoignei и Pseudomonas fluorescens GK 13 показала, что процесс гидролиза зависим от поверхностного слоя, где полимер подвергается действию бактериальных ферментов. Сканирующей микроскопией частично разрушенных образцов выявлено, что гидролиз начинается на поверхности, потом повреждение полимера продолжается частично и внутрь. Для не деградируемых полиоксиалканоатов этого не наблюдается (Molitoris et all., 1996; Yu et all., 2000). Так, (Doi and Iwata, 1992; Iwata et all., 1999) изучена деградация отдельных кристаллов сополимеров 3- оксибутирата с различными оксикислотами деполимеразой, выделенной из Alcaligenes faecalis T1. Энзиматическая деградация отдельных кристаллов продвигалась от края и конца кристалла до раскалывания на небольшие кристаллические фрагменты. Лямелярный слой отдельных кристаллов и молекулярный вес цепей сополимеров оставались при этом без изменений в течение энзиматического гидролиза. Полученные результаты подтверждают гипотезу, по которой гидрофобная адсорбция фермента способствует увеличению подвижности молекулярных цепей отдельных кристаллов и производит расстройство в области упаковки цепей. Активный участок ПОБ деполимеразы беспорядочно связывается с областью упаковки цепей краев и концов кристалла (Iwata et all., 1999). Энзиматическая деградация ПОА имеет ограничения вследствие затруднений, возникающих при диффузии гидрофильного фермента в гидрофобный полимер (Wu et all., 1998).

В литературе встречаются немногочисленные примеры изучения биодеградации ПОА. Так, изучены динамика разрушения сополимеров оксибутирата и оксивалерата, с различной величиной включения последнего (Madden et al., 1998) и установлено, что сополимерные образцы разрушаются быстрее. Стереоизомеры различных

188

структурных вариаций ПОА, полученные в различных режимах биосинтеза и химического синтеза, исследованы в работе (Abe et al., 1994). Биосинтетический полимер был взят из A. eutrophus и синтезирован химически из бутуролактона в присутствии различных катализаторов. Установлено, что добавлением атактического синтетического ПОБ можно изменять температурные характеристики и степень кристалличности материала в широком интервале, что значительно влияет на скорость разрушения. Среди водорастворимых продуктов гидролиза бактериального полимера обнаружена смесь димеров и мономеров, смесей [RS]-полимеров – смесь мономеров, димеров, тримеров и тетрамеров.

Выявлено, что морфология надмолекулярой структуры ПОА влияет на его биодеградацию (Canetti et al., 1999. Авторами исследованы пленки, полученные из расплава полимера при различных температурах, деградируемые экзодеполимеразой Aureobacterium saperdae. Увеличение степени кристалличности и размеров кристаллов приводило к уменьшению скорости деградации полимера. Отрицательное влияния увеличения степени кристалличности ПОА на скорость их биодеструкции отмечено также в работе (Kusaka, Doi, 1999). Авторами изучена разрушаемость высокомолекулярного полиоксибутирата, синтезированного рекомбинантным штаммом E. coli, трансформированного генами Ralstonia eutropha, под воздействием деполимеразы Al. faecalis. Выявлено существенное влияния на скорость деградации степени кристалличности материала и температуры среды и практическое отсутствие влияния на процесс величины молекулярной массы ПОА.

В модельных лабораторных системах (почве, почвенных вытяжках и воде) исследована кинетика разрушения пленок, изготовленных из ПОБ и сополимеров оксибутирата и оксивалерата (ПОБ-со- ПОВ) с различными исходными свойствами (таблица 5.1) (Волова с соавт., 1992а; 1996; 1998).

Таблица 5.1 Свойства ПОА, использованных для получения пленок и изучения

биодеградации

189