Биоинженерия / Polioxialkanoaty_POA__biorazrushaemye_polimery_dlya_meditsiny

20 %. Как правило, для этого используют обезжиренную поверхность стекол. В зависимости от химического состава полимера свойства, прежде всего, пористость и, следовательно, проницаемость изделий изменяется.

С целью определения возможности изготовления пленок из ПОА изучено поведение растворов полиоксибутирата и сополимеров оксибутирата с оксивалератом различной концентрации в ряде растворителей (хлороформе, диметилформамиде, дихлорэтане и смеси хлороформа и толуола). Исследованы растворы 5, 10 и15 % концентрации полимера (Волова с соавт., 2001; Волова с соавт., 2003). Оказалось, что из взятых систем только 15 % растворы ПОБ в хлороформе, дихлорэтане и диметилформамиде образуют связанный гель. Однако в процессе растворения ПОБ в диметилформамиде его молекулярная масса уменьшается практически в два раза. Поэтому полученные из данных растворов пленки и волокна были непрочными и разрывались при незначительных деформациях растяжения и изгиба. При использовании в качестве растворителя дихлорэтана и хлороформа изменений значения Mв полимера не отмечено, в связи с этим дальнейшие стадии процесса получения пленок и волокон (охлаждение и инклюдирование) исследовались, используя растворы ПОА различных концентраций от 5 до 15 %.

Пленки были получены методом полива из растворов ПОБ и ПОБ-со-ПОВ (рис. 4.5) на поверхность обезжиренных стекол или чашек Петри. Из представленных снимков видно, что топография поверхности изученных полимерных пленок в целом сходна. Однако более эластичные пленки из менее кристалличного сополимерного материала имеют выраженную пористую и ламинарную структуру по сравнению с ПОБ.

Рис. 4.5. Топография поверхности пленок: А – ПОБ, Б – ПОБ-со-ПОВ сополимер. Маркер 1 мкм. (Волова с соавт., 2001)

170

Свойства поверхности полимерных пленок, полученные на базе измеренных краевых углов и рассчитанные по известным уравнениям (Де Жен, 1987), представлены в таблице 4.6.

Как оказалось, химический состав материала, а именно, наличие оксивалерата в нем, практически не влияет на исследованные свойства поверхности пленок, включая величину контактного угла смачивания ( ), поверхностного натяжения (γ), свободной энергии межфазовой поверхности и величину сил сцепления (WSL). Статистически достоверных различий свойств поверхностей пленок, обращенных к воздуху или стеклу, не обнаружено (Волова с соавт., 2003). По изученным характеристикам гидрофобная поверхность пленок из ПОА близка к таковым у синтетических полиэфиров (полиэтилентерефталата, полиметилметакрилата, поливинилхлорида и полиэтилена)

Структура полимерных пленок и их свойства, главным образом, свойства поверхности, могут быть модифицированы и улучшены обработкой. Особенно значимы исследования такого рода для улучшения биосовместимых свойств полимерных изделий, предназначенных для биомедицинских применений. В связи с тем, что полиоксиалканоаты активно исследуются для изготовления внутрисосудистых стентов, элементов для регенерации костных тканей (пластин, штырей, винтов и других конструкций), контактирующих с тканями in vivo, разработка методов и технологий для повышения их биосовместимости и улучшения механических свойств весьма актуальна.

В работе (Yang et al., 2002) исследовано влияние обработки поверхности пленок из нескольких типов полимеров на биосовместимость. Сравнивали свойства поверхности пленок, полученных поливом из растворов, из полилактида (ПЛ), полиоксибутирата ПОБ) и сополимера оксибутирата с оксигексаноатом (ПОБ-со- ПОГ). Пленки обрабатывали раствором NaOН или липазами. Авто-

Таблица 4.6

Характеристика поверхности полимерных пленок, полученных из ПОА различного состава (Волова с соавт., 2003)

171

ры полагают, что в результате происходящих в ходе обработки полимеров гидролитических процессов увеличивается гидрофильность поверхности полимерных пленок и, как следствие, прикрепляемость клеток. Показано позитивное влияние обработки пленок всех типов липазами и, в еще большей степени, щелочью на адгезию и рост фибробластов мыши линии L929. При этом наилучшие результаты данного теста, практически на порядок превосходящие остальные типы пленок, зафиксированы для сополимера оксибутирата с оксигексаноатом.

Новым направлением модификации поверхности является обработка изделий физическими факторами или химическими реагентами с целью улучшения механических и биомедицинских свойств. Это делается для повышения адгезионных свойств поверхности по отношению к культивируемым животным клеткам, улучшения газодинамических свойств изделий и повышения их проницаемости для субстратов и продуктов обмена клеток. Химическая модификация включает изменение функциональных групп на поверхности полимерного материала, что повышает гидрофильность и обеспечивает лучшую прикрепляемость и лучший рост клеток. Один из подходов, применяемых для модификации поверхности изделий из ПОА, заключается в обработке газовой плазмой. При обработке, например, пленок из полиоксиоктаноата (ПОО) аммониевой плазмой в течение 10 мин. происходит включение в структуру пленки до 8 % азота (Nitschke et al., 2001). Это сопровождается значительным изменением свойств поверхности изделий; так, контактные краевые углы сокращаются на 20–30°. Поверхность становится гидрофильной, и это свойство сохраняется во времени. В ходе химической модификации поверхности полимерных пленок применяют также биологически активные и лекарственные вещества, способствующие лучшему прикреплению, росту клеток и дифференцировке формирующихся тканей. Например, при обработке газовой плазмой возможно применять активные формы биотина, аминокислоты и др. (Williams et al., 1999).

В последние годы стали появляться работы, в которых для модификации свойств ПОА начали применять лазерную обработку. В работе (Lootz et al., 2001) исследовано влияние СO2-лазера для обработки и пластификации поверхности мембран из ПОБ. Оказалось, что на поверхности мембран при лазерной обработке образуются специфические зоны различной ширины, от 10 мкм до 20– 40 мкм, с измененной структурой сферолитов. Как было установлено, при засеве на такие пленки клеток фибробластов мыши L 929 лучше всего клетки адгезировали и росли именно в месте возникновения этих зон.

172

4.3.3. Микрочастицы на основе ПОА

Полиоксиалканоаты активно исследуются в качестве биодеградируемой матрицы для депонирования и контролируемой доставки лекарственных средств. Особенно перспективным считается использование ПОА для получения микрочастиц, то есть в новейшей технологии, которая называется микроинкапсулированием.

Получение микрочастиц возможно различными методами, в том числе испарением растворов полимеров. При отработке технологии варьируют соотношение носителя и лекарства, типы полимеров, молекулярный вес, скорость кристаллизации, добавки. Получаемые при этом частицы различаются формой, размерами, структурой поверхности.

Типичное изображение полимерных микросфер приведено на рисунке 4.6. Микросферы приготовлены испарением эмульсии, которая готовилась следующим образом: к водно-жировой эмульсии, содержащей раствор желатина, добавляли раствор полимера в хлороформе. Смесь перемешивали и быстро приливали к раствору винилацетата при комнатной температуре, полученную систему встряхивали в течение нескольких часов, затем высушивали. Полученные микросферы промывали дистиллированной водой и высушивали вакуумированием (Embelton and Tighe, 1992a, b). В зависимости от условий получения (температуры среды, длительности встряхивания, молекулярной массы полимера и др.) микросферы получаются различного размера с различной степенью пористости и развитости поверхности.

Рис. 4.6. СЕМ снимки микросфер, полученных из ПОБ различного молекулярного веса (a) 43 000, (b) 159 000 (Embelton and Tighe, 1992a)

173

Как видно на рис. 4.6, микросферы, приготовленные из низкомолекулярного полимера (а), имели более рыхлую структуру по сравнению с микросферами, полученными из высокомолекулярного полимера.

Наиболее часто для получения микросфер используются полиоксибутират и его сополимеры с оксивалератом (Kassab et al., 1997; Ammas et al., 1998; Gürsel et al., 2000). Установлено, что:

–с увеличением оксивалерата в ПОБ-со-ПОВ скорость высвобождения лекарства обычно замедляется, однако микрочастицы, полученные на основе ПОБ, более хрупкие по сравнению с таковыми из сополимерного материала;

–с уменьшением размера частиц снижается их нагрузочная по отношению к лекарству способность, однако скорость высвобождения препарата возрастает;

–величина молекулярной массы полимера влияет на скорость выхода лекарства незначительно;

–выход лекарств из ПОБ и ПОБ-со-ПОВ происходит в результате диффузии, значительно ранее начала деградации собственно полимерного носителя;

–чем ниже содержание препарата в микрочастицах, тем ниже скорость его высвобождения.

Существуют и другие технологии для получения микрочастиц, в

том числе – ультразвуковая обработка растворов ПОА. Например, в работе (Puzyr et al., 2002) использовали 0.08 % (вес/объем) раствор полиоксибутирата в хлороформе. Варьируя условия получения и концентрацию ПОБ, оказалось возможным сформировать микрочастицы диаметром от 0,3 до 2,5 мкм (рис. 4.7) методом испарения растворителя. Для этого к раствору ПОБ в соотношении 1:2 добавляли дистиллированную воду, насыщенную хлороформом и диспергировали с помощью УЗДН-1УЧ2. Для фиксации частиц в образованную в процессе диспергирования эмульсию добавляли этиловый спирт.

Рис. 4.7. РЭМ снимок микрочастиц полиоксибутирата (Puzyr et al., 2002)

174

Диаметр полученных гранул составил от 2 до 300 мкм. Статистический анализ показал, что наблюдается логарифмическинормальное распределение частиц по размерам. Эти предварительные результаты, показавшие возможность получения однородных сферических гранул малых размеров, являются основой для дальнейшего развития работ по микроинкапсулированию.

4.3.4. Нанокомпозиты

Впоследние годы сформировалось новое направление, связанное с получением композиционных материалов из органических полимеров и неорганических наночастиц. Гибридные материалы, содержащие органические и неорганические соединения, обладают уникальным сочетанием свойств, которые находят полезные приложения от биологии до микроэлектроники. Основы этого научного направления были созданы при разработке высокомодульных полимерных материалов (Папков, 1974) и фотоэмульсий с наночастицами галогенидов серебра (Джеймс, 1980).

Вэтой связи была предпринята попытка создания нанокомпозита на основе полиоксибутирата (Пузырь с соавт., 2001). Идея создания такого материала основана на следующем: 1) при определенных условиях полиоксибутират образует фазу геля, 2) полиоксибутират полностью разрушается в окружающей среде без образования токсичных продуктов, 3) поверхность используемых частиц состоит из гидроксильных или оксифункциональных групп. Поэтому за счет взаимного сродства полимера и частиц друг к другу можно одновременно решить проблему пассивации поверхности наночастиц полимером.

1992). Порошки наноалмаза и оксида алюминия были получены взрывным методом. Наноалмазный порошок имел средний размер частиц порядка 4–5 нм, кубическую структуру с параметром решетки 0.356 нм, плотность кристаллов 3.1 г/см3, удельную площадь поверхности до 300 м2/г. Особенность использованного наноалмаза в том, что он содержит бор – 2.3 % массы (Ставер с соавт., 1984), причем бор предположительно находится в форме BN, который, как известно, увеличивает скорость зародышеобразования кристаллической фазы ПОБ (Withey and Hay, 1999). Порошок оксида алюминия ( -Al2O3) имел удельную площадь поверхности порядка 20 м2/г и состоял из частиц сферической формы. Распределение частиц по размерамлогарифмически нормальное со следующими параметрами: d0.5 = 70 нм, дисперсия = 1.9. Условия получения определяют стабилизацию оксида алюминия в фазе. Поверхностный слой частиц (порядка 2 нм) обогащен более высокотемпературной модификацией оксида, для которой характерна моноклинная структура.

175

Добавка порошков наноалмаза или оксида алюминия к раствору ПОБ в хлороформе с последующей обработкой ультразвуком позволила создать гомогенные, но неустойчивые суспензии. Через 5– 10 мин. в таких суспензиях происходило спонтанное выпадение агрегатов наночастиц в осадок, несмотря на достаточно высокую вязкость используемого раствора полимера (14–20 масс. %). После нанесения суспензии на стеклянную подложку методом полива испарение растворителя сопровождалось агрегированием наночастиц. Это приводило к неравномерному распределению агрегатов в подсыхающем растворе полимера и впоследствии – к нарушению целостности формирующейся пленки (рис. 4.8).

Для создания устойчивого наполненного наночастицами композита полимер был исследован в состоянии геля, который обладает большей, чем у раствора, вязкостью и способен поддерживать в своем объеме взвешенные частицы как на начальных стадиях их образования, так и в процессе стабилизации геля (рис. 4.9). Раствор полиоксибутирата в хлороформе с концентрацией полимера 14 г/л переводили в гель при комнатной температуре. В полученных гелях наблюдалось явление синерезиса и уменьшение прозрачности. Появление в геле избыточного, по сравнению с раствором, светорассеяния, возможно, связано с появлением в нем локальных областей кристаллизации полимера.

Гель, содержащий наночастицы алмаза или алюминия, при нанесении на стеклянную подложку после испарения жидкой фазы образует сплошную однородную пленку с равномерным распределением наночастиц по ее площади (рис.4.10).Стабилизация наночастиц в объеме, вероятно, происходит за счет их фиксации в сетке геля. Исходя из приведенных выше результатов, можно предположить, что полимер поли- -гидроксимасляной кислоты может оказаться полезным компонентом для создания биодеградируемых систем с другими наночастицами. Полученный в работе нанокомпозит из частиц наноалмаза или оксида алюминия в полигидроксибутирате является первым примером нового семейства гибридных материалов из органического полимера и неорганических наночастиц.

Таким образом, в результате был синтезирован гибридный композит «биополимер – наночастицы». Найдены условия получения однородного и стабильного во времени распределения наночастиц алмаза или δ-Al2O3 в объеме геля из поли- -гидроксибутирата. Получены объемные образцы и пленки из биополимера с равномерно распределенными в них частицами наноалмаза или оксида алюминия.

176

4.3.5. Использование ПОА для получения пористых конструкций для тканевой инженерии

Анализ работ в области трансплантологии и искусственных органов, появившихся к началу XXI столетия, дает основание говорить о появлении принципиально нового подхода к восстановлению функций жизненно важных органов – использование технологий генной, клеточной и тканевой инженерии. Проводимые исследования можно разделить на две группы: разработка биоискусственных (гибридных) органов и тканей, клонирование органов и тканей из собственных стволовых клеток пациента in vitro в специальных биореакторах.

Гибридные (биоискусственные) системы должны сочетать в себе свойства живой и неживой ткани таким образом, чтобы, при необходимости, полностью или частично, временно или постоянно заменить функции тех или иных утраченных естественных органов. Полиоксиалканоаты в последние несколько лет стали считать наиболее перспективным материалом для изготовления матриксов и пористых конструкций применительно к задачам клеточной и тканевой трансплантологии. Одной из ключевых проблем создания биоискусственных органов и тканей является разработка биодеградируемых двухмерных (пленочных) и трехмерных (губки) матриксов для функцио-

нирующих клеток (Bioartificial Organs.,1997;1999; Williams et al., 1999; Wang et al., 2001; Hu et al., 2002; 2003).

Матриксы (scaffolds) для биоискусственных органов должны обладать многофункциональностью, достаточной механической прочностью и эластичностью, биосовместимостью на белковом и клеточном уровне, способностью стимулировать пролиферацию и дифференциацию клеток, способностью к неоваскуляризации и возможностью стерилизации без изменения медико-технических свойств.

Как было отмечено, изделия из ПОА можно получать различными способами, в том числе из полимеров, находящихся в различных фазовых состояниях (растворы, латексы, расплавы, порошки). Это открывает пути для использования ПОА в качестве матриц для тканевой инженерии. Один из способов получения пористых матриц из ПОА – это получение двухкомпонентных смесей и последующее выщелачивание в растворе одного из компонентов, обладающего растворимостью в данной системе (Thomson et al., 1997). Альтернативой такому способу является использование техники образования волоконных структур. Обычно получают пористые микротрубочки из ПОА. Как правило, для этого к раствору или расплаву ПОА добавляют частицы хлорида натрия размером от 80 до 200 мкм в соотношении полимер:соль, как 1:2. Из смеси формуют изделия, которые потом промывают водой. В качестве подложки при формовании волокноподобных трубочек используют, например, тефлон (Williams et al.,

178

1999). Применение многокомпонентных растворных систем ПОА позволяет получать гамму пористых материалов с пористостью до 90 % при размере пор от 100 до 350 мкм (Hu et al., 2002).

На рис. 4.11 представлена микрофотография поверхности модифицированной пленки, изготовленной из полиоксбутирата с целью изучения применимости в качестве матрицы для тканевой инженерии (Nitschke et al., 2001). Пленки, полученные из раствора ПОБ в хлороформе (полимер фирмы Merck, product name Methanomer®),

подвергали плазменной обработке с использованием аммония. Пленки имели толщину около 40 мкм и пористую поверхность.

Плазменная обработка вела к образованию на поверхности ПОБ амино-групп, что существенно изменяла структуру поверхности. В зависимости от длительности обработки плазмой контактные краевые углы пленок изменялись от 17 до 60°. Это, в свою очередь, влияло на смачиваемость поверхности, следовательно ее сродство к адсорбируемым клеткам. Подобный дизайн весьма перспективен для разработки конструкций, поддерживающих рост клеток тканей и органов in vitro для целей реконструктивной хирургии.

Большие надежды связываются с ПОА применительно к регенерации костных тканей. В последние годы все большее развитие получат исследование, направленные на разработку хирургических конструкций для регенерации и лечения поврежденных костных структур с помощью пористых биодеградируемых материалов вместо используемых металлических конструкций. Наряду с коллагеном, полилактидами и полигликолидами, изучаемыми для этих целей в настоящее время, все большее количество публикуемых работ ориентировано на полиоксиалканоаты. Показано, что различные типы ПОА, в частности, полиоксибутират и его сополимеры с оксивалератом, полиоксиоктаноатом и др., можно успешно использовать в композиции с коллагеном, полилактидами, гидроксиапатитом для получения конструкций, предназначенных для культивирования остеобластов и хондроцитов in vitro с последующим использованием in vivo.

Рис. 4.11. Электронномикроскопическое изображение пористой пленки из ПОБ (Nitschke et al., 2002).

179