1.4.2.2 Регуляция активности Cdk посредством фосфорилирования/дефосфорилирования
Помимо циклиновых белков существуют также дополнительные механизмы тонкой регуляции активности Cdk на каждой стадии клеточного цикла.
Так, например, фосфорилирование двух аминокислотных остатков в составе активного центра Cdk при участии киназы Wee1 приводит к ингибированию киназной активности последней. Напротив, дефосфорилирование этих остатков фосфатазой Cdc25 восстанавливает активность Cdk (Рис. 13). Данный регуляторный механизм имеет особое значение на начальных стадиях митоза.
Кроме того, активность комплексов циклин–Cdk регулируется белками, ингибирующими Cdk (CKI), такими как белок р27. Исследование трехмерной структуры комплекса циклин–Cdk–CKI показало, что связывание CKI приводит к значительным изменениям в структуре активного центра Cdk, в результате чего происходит его инактивация (Рис. 14). Как правило, при участии CKI осуществляется регуляция активности G1/S- и S-Cdk на ранних стадиях клеточного цикла.
1.4.2.3 Протеолитическая регуляция активности Cdk
В то время как активность комплексов циклин-Cdk, контролирующих прогрессию через стартовую точку и точку контроля G2/M клеточного цикла, регулируется путём фосфорилирования/дефосфорилирования, дальнейшая прогрессия клеточного цикла от метафазы к анафазе регулируется протеолитическими ферментами, расщепляющими регуляторные белки.
Рис. 13 Механизм регуляции активности Cdk посредством фосфорилирования/дефосфорилирования
Рис. 14 Регуляция активности Cdk ингибирующим белком р27
Главным регулятором перехода от метафазы к анафазе является комплекс индуцирующий анафазу или циклосома (APC/C, anaphase-promoting complex), относящаяся к семейству убиквитин-лигаз. Ферменты этого семейства осуществляют транспортировку небольшого белка убиквитина к специфическим белкам-мишеням, в результате чего они расщепляются протеосомами.
Комплекс APC/C осуществляет убиквитирование и деструкцию таких белков как секурин, также S- и М-циклины. Белок секурин предохраняет от протеолиза линкерные белки, которые удерживают вместе сестринские хроматиды на ранних стадиях митоза. Расщепление секурина при переходе от метафазы к анафазе приводит к тому, что линкерные белки также подвергаются деструкции и происходит расхождение сестринских хроматид и запуск анафазы.
Деструкция циклинов приводит к инактивации большинства Cdk в клетке. В результате, многие из белков, фосфорилированных на промежутке клеточного цикла от S-фазы до начальных стадий митоза подвергаются дефосфорилированию под действием фосфатаз, присутствующих в клетке на стадии анафазы. Дефосфорилирование белков-мишеней Cdk необходимо для завершения М-фазы, включая последние стадии митоза и цитокинез. Комплекс APC/C активируется в середине митоза, и его активность сохраняется в стадии G1, обеспечивая длительный период отсутствия активности Cdk. Когда происходит активация G1/S-Cdk, комплекс APC/C инактивируется. В результате происходит накопление циклинов, необходимое для запуска следующего клеточного цикла.
В регуляции клеточного цикла также принимает участие убиквитин-лигаза SCF. Данный фермент осуществляет убиквитирование нескольких белков CKI на поздних этапах стадии G1, и, таким образом, регулирует активность S-Cdk и репликацию ДНК.
Оба фермента, APC/C и SCF, представляют собой сложные многосубъединичные комплексы. Несмотря на то, что данные комплексы имеют в своем составе ряд одинаковых субъединиц, регуляция их активности осуществляется разными способами. Активность APC/C на разных стадиях клеточного цикла определяется связыванием активирующей субъединицы Cdc20 в анафазе или же Cdh1 на поздних стадиях митоза и ранних этапах стадии G1. Данные субъединицы необходимы для правильного распознавания субстрата комплексом APC/C (Рис. 15).
Рис. 15 Регуляция активности Cdk комплексом APC/C.
На стадии митоза происходит активация комплекса APC/C посредством связывания активирующей субъединицы Cdc20, которая распознает специфическую аминокислотную последовательность в составе М-циклина и ряда других белков-мишеней. С помощью вспомогательных белков Е1 и Е2, комплекс APC/C осуществляет перенос нескольких молекул убиквитина на белок-мишень. Затем, убиквитилированные белки подвергаются деградации протеосомой .
Рис. 16 Регуляция активности Cdk комплексом SCF.
Активность убиквитин-лигазного комплекса SCF зависит от присутствия субстрат-связывающей субъединицы, называемой белком F-box. Фосфорилирование белков-мишеней, таких как CKI, делает возможным их распознание субъединицей F-box .
Активность комплекса SCF зависит от присутствия, так называемого, белка F-box, который также способствует распознанию соответствующих белков-мишеней. Однако, в отличие от комплекса APC/C, активность SCF остается неизменной в течение всего клеточного цикла. Процесс убиквитирования белков-мишеней при участии SCF регулируется уровнем фосфорилирования белков-мишеней, так как субъединица F-box способна распознавать только те белки, которые подверглись фосфорилированию по строго определенным аминокислотным остаткам (Рис. 16).