2.2 Белок Ras играет центральную роль в сложных сигнальных каскадах
Начало изучению роли белка Ras в механизмах внутриклеточной сигнализации было положено в работах по изучению генетических механизмов, лежащих в основе развития глаз Drosophila melanogaster. При этом были выявлены гены, продукты экспрессии которых играют ключевую роль в нормальном развитии светочувствительных структур сложных глаз. Один из этих генов получил название sevenless, так как его выключение нарушало формирование седьмой клетки каждой светочувствительной единицы (Рис. 21).
Рис. 21 Строение глаза Drosophila melanogaster
Примечание: Исследование строения светочувствительных элементов глаза Drosophila melanogaster показало, что каждая такая единица формируется из семи клеток, шесть из которых расположены по диаметру, а седьмая - в центре. У мух, несущих мутантную форму гена sevenless центральная клетка отсутствует. Позже было установлено, что ген sevenless кодирует гомолог фактора роста эпидермиса (epidermal growth factor, EGF) .
Позднее было установлено, что мутации в других генах приводили к формированию фенотипа, сходного с sevenless-мутацией. Как оказалось, данные мутации затрагивали гены, продукты экспрессии которых функционировали в составе сигнальных каскадов, контролируемых продуктом экспрессии гена sevenless. Один из таких генов получил название sos (son of sevenless). Исследование белка Sos показало, что он сходен с белками, осуществляющими обмен нуклеотидов в клетках дрожжей при участии G-белков, таких как Ras. Было показано, что белок Sos, подобно факторам обмена гуаниновых нуклеотидов (GEFs) дрожжей, осуществлял обмен ГДФ на ГТФ в составе белка Ras, переводя его в активное состояние (Рис. 22).
Рис. 22 Принцип работы белка Sos
Впоследствии были выявлены и другие участники данного сигнального пути, в том числе белки Shc, Crk и Grb2. Было установлено, что данные белки функционируют в качестве адапторов и образуют мостики между факторами роста и белком Sos. При этом было установлено, что Crk является онкобелком, кодируемым вирусом саркомы птиц СТ10.
2.3 Фосфорилирование остатков тирозина регулирует локализацию и функции многих сигнальных белков
Фосфорилирование остатков тирозина является фундаментальным механизмом регуляции активности белков, а также белок-белковых взаимодействий. В настоящее время известно, что многие рецепторы факторов роста обладают тирозинкиназной активностью.
Существует два возможных механизма, посредством которых фосфорилирование остатков тирозина может оказывать влияние на механизмы внутриклеточной сигнализации. Согласно первой версии, ассоциированная с рецептором тирозинкиназа осуществляет фосфорилирование белков-мишеней в цитоплазме, что приводит к конформационным перестройкам белковых молекул. В результате такой модификации белки могут переходить либо в активное состояние, либо, напротив, - в неактивное, и, таким образом запускать или «выключать» соответствующий сигнальный каскад. Согласно другой модели, фосфорилирование цитоплазматического домена рецептора, индуцированное связыванием лиганда (фактора роста), приводит к изменению внутриклеточной локализации его партнеров по сигнальному каскаду. При этом собственная активность цитоплазматических белков может не изменяться. В результате такой реорганизации может достигаться такое взаимное распределение белков-партнеров, которое способствует передаче сигнала к дальнейшим мишеням.
Как оказалось, вторая модель имеет первостепенное значение. В составе белка Srcбыли выявлены три домена, гомологи которых были впоследствии обнаружены и в составе других белков (Src homology domains 1, 2 и 3; SH1, SH2, SH3), и которые играют центральную роль в механизме передачи сигнала от рецептора на внутриклеточный уровень (Рис. 23).
Кристаллографический анализ структуры белка Src показал, что молекула белка Src состоит из трех структурных доменов. Каталитический домен SH1, в свою очередь, также построен из двух доменов, получивших названия N- и C-lobed доменов. Между ними располагается сайт связывания АТФ, где и происходит катализ. Домены SH2 и SH3 участвуют в распознавании субстрата, регуляции каталитической активности и модулировании белок-белковых взаимодействий между партнерами по сигнальному пути.
Рис. 23 Структура белка Src
Домены SH2 были также обнаружены в составе молекул фосфолипазы С и фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K). Характерной особенностью доменов SH2 является их сродство к белкам, имеющим в своем составе остатки фосфотирозина (Рис. 24).
Благодаря связыванию таких белков с доменами SH2 может достигаться их распределение во внутриклеточном пространстве, требуемое для трансдукции сигнала. Таким образом, данные наблюдения указывают на то, что каталитический домен и домен SH2 функционируют как независимые структурные модули.
На Рис. 25 показана схема трансдукции сигнала посредством тирозинкиназного рецептора на внутриклеточный уровень на примере рецепторов фактора роста тромбоцитов (PDGF-β) и фактора роста эндотелия (EGF). Связывание лиганда с рецептором сопровождается фосфорилированием остатков тирозина в составе цитоплазматического домена рецептора при участии ассоциированной с ним тирозинкиназы. Остатки фосфотирозина, а также фланкирующие их с С-конца аминокислотные мотивы специфически распознаются SH2-доменами многих сигнальных белков. Например, рецептор PDGF, активированный связыванием лиганда обладает сродством к Src, PI3K, Ras-GAP, SHP2 и PLC-γ. В состав каждого из этих белков входит, по меньшей мере, один SH2-домен, способный связывать остатки фосфотирозина в составе цитоплазматического хвоста рецептора PDGF. Как только эти SH2-содержащие белки оказываются связанными с рецептором PDGF, часть из них сами подвергаются тирозин-фосфорилированию при участии PDGF-R-ассоциированной тирозинкиназы.
Рис. 24 Структура домена SH2
В связанном с рецептором состоянии данные SH2-содержащие белки способны запускать соответствующие сигнальные процессы на внутриклеточном уровне. Некоторые из этих белков активирую также петли отрицательной обратной связи, выключая, таким образом, соответствующий сигнальный путь. Возможность трансдукции сигнала внутрь клетки обеспечивается также тем, что связываясь с цитоплазматической частью фосфорилированного рецептора, SH2-содержащие белки оказываются в непосредственной близости от липидных и белковых компонентов мембраны. Так, например, белок Ras-GAP (Ras GTPase-activating protein) оказывается в непосредственной близости к белкам Ras, многие из которых заякорены в мембране своими С-концевыми липид-содержащими хвостами. Это позволяет белку Ras-GAP взаимодействовать с близлежащими молекулами Ras, стимулируя гидролиз ГТФ, что приводит к переходу белков Ras из активной формы в неактивную.
Аналогично, PI3K и PLC-γ, связанные с рецептором, оказываются в непосредственной близости от инозитол-содержащих липидов мембраны. В результате осуществляется расщепление фосфатидилинозитол (4,5)-дифосфата (PIP2) с образованием двух продуктов, каждый из которых выполняет самостоятельную сигнальную функцию.
Рис. 25 Взаимодействие фосфорилированных рецепторов с сигнальными белками на примере рецепторов фактора роста тромбоцитов (PDGF) и фактора роста эндотелия (EGF)
Домен SH3 способен специфически связываться с богатыми пролином участками полипептидных цепей белков-партнеров. В составе белка Src домен SH3 распознает и связывает субстраты, имеющие в своем составе домены богатые пролином, которые затем подвергаются фосфорилированию с участием Src-связанной киназы.
Таким образом, наличие специализированных доменов в составе сигнальных белков позволяет им осуществлять специфические белок-белковые взаимодействия, обеспечивая направленную передачу сигнала к соответствующим мишеням. Исследование структуры и функции белка Src позволило выявить механизмы его функционирования в нормальных клетках и в клетках саркомы Рауса.