Бёккер_Хроматография [2009]
.pdf
180
Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография
Линейный Составной линейный
Время |
Время |
Вогнутый |
Выпуклый |
Время |
Время |
Рис. 4.8. Возможные режимы градиентного элюирования
на рис. 4.8. Очевидно, что следующие друг за другом растворители должны сме& шиваться между собой, и перед началом подачи новой пробы должно быть вос& становлено исходное соотношение отдельных растворителей в смеси.
В некоторых случаях можно достичь удовлетворительной воспроизводимос& ти также без соблюдения вышеупомянутых критериев, если разделение компо& нентов пробы не представляет проблемы. В любом случае, указание воспроизво& димости применимо всегда только для соответствующих тестовых условий. Важ& но создать общие предпосылки для воспроизводимости результатов анализов, причем следует уделять внимание «правильному смешению» с учетом уменьше& ния объема смеси растворителей и постоянству потока элюента с учетом сжимае& мости смеси растворителей. Дополнительно должны быть решены, конечно, про& блемы дегазации растворителей, а также приборного оформления.
Градиентные системы низкого и высокого давления появились сначала как обычная вынужденная мера. Первая программируемая градиентная система была сделана как дополнение к изократической системе ВЭЖХ с одним насосом высо& кого давления и устройством управления.
Разработка градиентной системы высокого давления требовала только не& значительных дополнительных затрат. При этом высокие аппаратные издержки градиента высокого давления способствовали развитию системы градиента низ& кого давления. К всасывающей линии уже имеющегося насоса высокого давле& ния подключались два или три клапана для переключения растворителей, чей такт и определял соотношение компонентов смеси. Таким образом, можно было смешивать до трех растворителей с относительно небольшими затратами на обо& рудование.
4.3. Градиентное элюирование 181
4.3.1. Градиент низкого давления
При градиенте низкого давления компоненты элюента смешиваются на стороне низкого давления за счет магнитных клапанов с временным управлением или раз& личных прецезионных насов низкого давления, чтобы затем подаваться в систему насосом высокого давления. Рис. 4.9 показывает блок&схему системы тройного гра& диента низкого давления. На всасывающей части насоса высокого давления нахо& дится камера смешения, которая через три магнитных клапана связана с тремя ем& костями для растворителей A, B и C. Преимуществом данной тройной градиентной системы являются, в частности, относительно невысокие затраты на оборудование.
Примечательно то, что эта система позволяет поддерживать постоянную ско& рость потока при условии, что насос располагает автоматическим устройством для компенсации сжимаемости элюента или другим подходящим устройством для поддержания постоянного потока. Так как величина потока зависит в первую оче& редь от переменных коэффициентов сжимаемости смеси растворителей, то есте& ственно имеет смысл поддерживать постоянную скорость потока с помощью ав& томатической обратной связи с датчиком сжимаемости.
Объем системы создания градиента должен быть настолько небольшим, на& сколько это возможно, чтобы избежать диффузионного искажения градиента. В простейшем случае используют различные емкости для разных составов элю& ентов, в которые одну за другой помещают всасывающую линию насоса высокого давления. Более элегантно переключение с помощью магнитного клапана, кото& рый к тому же может управляться автоматически. Клапаны открываются на раз& личную величину подачи или на различное время, вследствие чего изменяется состав элюента в камере смешения.
Существенный недостаток системы c градиентом пониженного давления со& стоит в том, что всасывающая фаза насоса высокого давления не может быть од&
Вентиль
Растворитель
Насос
Камера
смешения
Микропроцессорное управляющее устройство
Рис. 4.9. Тройная градиентная система низкого давления
182
Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография
нозначно определена, так как фактически начало всасывания зависит от сжимае& мости растворителя и давления на колонке. Если поршень механически начинает фазу всасывания, то объем элюента, присутствующего в цилиндре насосов при атмосферном давлении, расширится и замедлит фактическое начало всасываю& щей фазы. Вместе с тем это обстоятельство создает принципиальную проблему для синхронизации фазы всасывания и времени переключения магнитных кла& панов. Если, например, нужно подать 5% растворителя A, то возможно, что вса& сывающий поток в период всасывания первых 5% вовсе не эффективен и, таким образом, растворитель A не попадает в камеру смешения. Тем не менее, с помо& щью специальных приемов можно дозировать компоненты с минимальными про& центными долями в желаемых процентных соотношениях. Другая возможность заключается в том, чтобы сместить время короткого включения магнитных кла& панов на конец фазы всасывания. В обоих случаях нерегулярности потока долж& ны сглаживаться с помощью увеличенной камеры смешения.
Неконтролируемый забор компонентов растворителя вызывает также сжатие объема при смешивании. Если вначале в камеру смешения забирается раствори& тель A, то скорость потока A согласуется со скоростью забора. Если теперь добав& ляется компонент B, то скорость его потока возрастает в соответствии с тем, как сжимается объем смеси.
Теоретически соотношение компонентов в смеси определяет время включе& ния клапанов, управляющих подачей растворителей, так как, однако, по выше& упомянутым причинам скорости потоков в линиях подачи могут меняться, то со& отношение компонентов смеси на выходе насоса высокого давления всегда от& клоняется от заданного значения. Рис. 4.10 показывает типичный ход состава гра& диентной смеси в зависимости от заданного значения. Чтобы сгладить неизбежные флуктуации состава смеси, в этих системах необходимы камеры смешения боль& ших объемов (до 4 мл), чем в системах градиента высокого давления. В большин& стве случаев камеры смешения устанавливают одновременно и на стороне низко&
А Экспериментальное значение
Найдено
Задано
A Заданная величина
Рис. 4.10. Типичные отклонения экспериментальных значений от заданных вели& чин в градиентной системе низкого давления
4.3. Градиентное элюирование 183
го давления, и на стороне высокого давления. Это, естественно, значительно уве& личивает время, когда градиент достигнет колонки.
У систем низкого давления есть то преимущество, что можно присоединить сколь угодно много емкостей для растворителей и, как результат, полярность мо& бильной фазы при градиенте можно менять в широких пределах. Кроме того, они относительно дешевы.
4.3.2. Градиент высокого давления
Системы градиента высокого давления дороже, но, благодаря высокоразвитой электронике, они просты в работе, очень гибки и легко автоматизируемы. Для каждого растворителя нужен отдельный насос высокого давления, то есть для бинарной градиентной системы необходимы два насоса высокого давления. Сна& чала основной (или даже весь) поток создает насос со слабым элюентом, а насос с сильным элюентом добавляет лишь немного или вовсе ничего. Доля потока от каждого насосов в суммарном потоке может меняется плавно или ступенчато, линейно или экспоненциально. Электронное управление должно следить за тем, чтобы суммарный поток, создаваемый двумя насосами, оставался постоянным.
Камера смешения, расположенная за насосами, должна быть маленького объе& ма, не должна иметь мертвых углов и должна обеспечивать полное смешение обо& их компонентов. Так как две жидкости под высоким давлением плохо смешива& ются друг с другом, то в камеру смешения помещают маленький генератор ульт& развука, который способствует быстрому и тщательному смешиванию обоих ра& створителей.
Рис. 4.11 показывает принципиальную схему бинарной системы градиента высокого давления. Преимущества системы – это короткое время отклика при
Растворитель Насос
Насос
Камера смешения
Микропроцессорное управляющее устройство
Рис. 4.11. Бинарная градиентная система высокого давления
184
Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография
скачкообразной форме градиента и получение смеси точного состава. Недостат& ками являются: высокие затраты на оборудование, особенно для тройных гради& ентов, недостаточная точность смешивания при низких скоростях потока и низ& ком содержании компонентов в смеси, а также изменение скорости потока в за& висимости от сжимаемости смеси растворителей.
Насосы с малым ходом поршня часто показывают неудовлетворительное по& стоянство потока в области скоростей от 0 до 0,1 мл в минуту. При этом соблюде& ние точного числа оборотов привода не представляет проблемы. Основная при& чина непостоянства потока – это протекание клапанов насоса, которое трудно избежать на практике. Периодическая или импульсная работа насоса при подаче малых количеств растворителя, в случае его малой процентной доли в смеси, не может решить эту проблему, так как, естественно, что даже если насос не подает растворитель, его клапаны находятся под рабочим давлением, создаваемым вто& рым насосом. Поэтому небольшая часть объема, поданного первым насосом, в паузах между фазами подачи вытесняется обратно в цилиндр первого насоса.
Следующий фактор, который влияет на постоянство или непостоянство гра& диента, обусловлен постоянной пульсацией потока. Относительная величина пуль& сации возрастает с уменьшением скорости потока, и отрицательное влияние это& го эффекта может компенсироваться только увеличением камеры смешения. Это противоречит требованию короткого времени отклика для градиента. На практи& ке объем камеры смешения не может быть значительно меньше 2 мл, причем пуль& сация градиента возрастает с уменьшением скорости потока.
Очень существенный недостаток градиента высокого давления связан с тем, что при смешивании постоянных объемов растворителей A и B происходит умень& шение объема и реальная скорость потока больше не соответствует заданной ско& рости. Это сжатие объема зависит от соотношения компонентов в смеси и, следо& вательно, также от ранее упомянутых пульсации и скорости утечки через клапа& ны насосов. Тем не менее, колебания скорости потока очень мешают при интег& рировании площадей пиков. На рис. 4.12 представлена типичная зависимость
Задаваемая скорость потока
Mетанол/вода
Рис. 4.12. Зависимость скорости потока от соотношения компонентов смеси
4.4. Системы ввода пробы 185
скорости потока от соотношения компонентов смеси. При соотношении компо& нентов смеси 50% воды к 50% метанола скорость потока отличается примерно на 12% от заданной скорости.
4.3.3. Оптимизация градиента
Применение градиентного элюирования в жидкостной хроматографии с целью достижения возможно более полного разрешения пиков при минимальном вре& мени анализов соответствует разделению в газовой хроматографии с программи& рованием температуры. При этом развитие методов градиентного элюирования рассматривается скорее как искусство, чем наука. Отработанный метод ВЭЖХ анализа – это результат многочисленных, часто продолжительных шагов по оп& тимизации условий разделения:
•начальный и конечный состав подвижной фазы,
•крутизна градиента и
•выбор самих растворителей для градиента.
Так же, как в ГХ с температурным программированием, для этого существуют специальные компьютерные программы. Оптимизацию метода начинают с вы& полнения двух линейных градиентов, причем состав элюентов тот же самый в на& чале и в конце градиента, но градиенты имеют разный наклон. В программу вво& дятся названия компонентов, время удержания, площади пиков и факторы асим& метрии. По этим данным программа как бы «калибруется» на используемую ко& лонку и элюенты. Программа отвечает на три основных для разделения вопроса: выполнимо ли разделение, какое время градиента дает лучшее разрешение и на& сколько надежно разделение, т.е. как быстро уменьшается разрешение, если вре& мя градиента изменяется [4.7].
Затем программа симулирует наилучший линейный градиент. Для более слож& ной пробы лучшего разрешения можно достичь, если использовать градиент, раз& деленный на сегменты. Можно симулировать мультилинейные градиенты с раз& личными сегментами. Даже изогнутые градиенты могут симулироваться подхо& дящей комбинацией линейных сегментов. Идентификация пиков, масштабиро& вание и возможность изменения шкал дают с первого взгляда исчерпывающую информацию об условиях разделения.
После того как были выбраны оптимальные условия градиента, можно быстро исследовать влияние таких факторов, как геометрия колонок, величина частиц сор& бента и скорость потока. При этом время градиента автоматически подстраивается под вносимые изменнения. Предсказанное компьютером и экспериментально из& меренное время удерживания отличается, как правило, меньше, чем на 1%.
4.4. Системы ввода пробы
Ввод пробы должен обеспечивать воспроизводимую подачу на колонку точно определенного объема раствора пробы без прерывания потока элюента. Количе& ство пробы зависит от чувствительности детектора к отдельным компонентам и
186
Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография
от разбавления пробы в хроматографической системе, а также и от допустимой нагрузки колонки.
Хорошая система ввода проста в обращении и вносит только незначительный вклад в уширение пиков. Разумеется, она должна обеспечивать воспроизводимость объема вводимой пробы. Кроме того, она должна допускать работу с высоким дав& лением до 400 бар и с различными объемами вводимой пробы. Очевидно также, что устройство ввода пробы должено быть химически инертным. Для специаль& ных задач, таких как разделение белков, сегодня имеются системы ввода пробы, в конструкции которых отсутствует нержавеющая сталь и выполненных из титана, керамики или пластмассы.
Возможности ввода пробы многообразны и часто являются критическим пун& ктом при анализе, так как лучшие колонки могут давать плохие результаты, если устройство ввода пробы не соответствует предъявляемым к нему требованиям. Пожалуй, самый простой метод – это ввод пробы шприцом через прокладку, как это принято в газовой хроматографии. Проблемы при этом методе ввода возни& кают из&из высокого давления подвижной фазы. Более новые системы ввода де& лают возможными ввод пробы без всякого давления в дозирующую петлю непос& редственно перед колонкой.
Сегодня обычно различают два вида ввода пробы: ручной и автоматический. При вводе пробы вручную дозирование может происходить либо с помощью шпри& ца, либо через объем петли, причем последний метод ведет к более точным и вос& производимым результатам и вообще сегодня рассматривается как более пред& почтительный.
4.4.1. Ввод пробы через прокладку
Пожалуй, самый простой метод – это ввод пробы со шприцем через проклад& ку в блоке ввода. Прокладка – это эластичная, самоуплотняющаяся шайба из си& ликоновой резины, которую прокалывают иглой. При давлениях до 100 атм под& ходит хороший шприц для ГХ, если его поршень не слишком толст. Шприц объе& мом 100 мкл имеет уже такой толстый поршнь, что при этих давлениях введение пробы становится невозможным. Специальные шприцы высокого давления до& роги, но могут применяться до 400 атм. У этого метода есть то преимущество, что проба непосредственно впрыскивается на колонку и объемы пробы варьируются. Принцип представлен на рис. 4.13. Нужно выбирать, таким образом, длинные иглы, чтобы они доставали до поверхности сорбента, но ни в коем случае не по& вреждали ее. Ввод пробы должен происходить достаточно быстро.
4.4.2.Дозирующая петля
Вкачестве стандартного метода ввода пробы в ВЭЖХ используется дозирующая петля с шестиходовым краном, которая раполагается непосредственно перед ко& лонкой. Этот кран высокого давления обладает двумя положениями, LOAD и INJECT, как представлено на рис. 4.14. В зависимости от положения крана соот& ветствующие каналы соединяются друг с другом.
4.4. Системы ввода пробы 187
Прокладка
Подвижная фаза
Фритта
Хроматографическая колонка
Рис. 4.13. Устройство ввода пробы через прокладку
Заполнение петли |
Ввод пробы на колонку |
Рис. 4.14. Ввод пробы через дозирующую петлю: 1 – дозирующая петля; 2 – канал ввода пробы; 3 – канал сброса избытка пробы; 4 – канал соединения с насосом высокого давления; 5 – канал соединения с хроматографичес& кой колонкой
ПОЛОЖЕНИЕ LOAD – ЗАПОЛНЕНИЕ ПЕТЛИ
Пробу вводят в петлю с помощью шприца без давления с 3–5&кратным избытком объема петли для равномерного заполнения петли. Излишек отводится через со& ответствующий канал. В это время элюент продолжает поступать от насоса через кран на колонку при постоянном рабочем давлении.
188
Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография
ПОЛОЖЕНИЕ INJECT – ВВОД ПРОБЫ НА КОЛОНКУ
Клапан поворачивается в положение ввода. Теперь элюент идет от насоса через петлю и вымывает пробу на колонку.
Петли имеют объемы от 1 до 1000 мкл. Их можно легко заменять и монтиро& вать в дозирующем кране. Преимущества петлевого ввода:
•выбранный объем очень хорошо воспроизводится и меньше зависит от опе& ратора, чем при мембранном вводе, так что метод хорошо подходит для ко& личественного анализа;
•не нужно вводить пробу против давления в системе и портить шприц;
•система может быть автоматизирована, переключение крана происходит либо пневматически, либо с помощью электродвигателя;
•также просто и быстро подаются большие объемы пробы, поэтому метод хорошо подходит для препаративной работы.
4.5. Колонки для ВЭЖХ
Всовременной ВЭЖХ используют сорбенты с величиной зерна от 3 до 10 мкм. Применение этих носителей стало возможно только после того, как для их при& менения были созданы соответствующие приборы и инструменты. Высокий стан& дарт качества и разнообразие предлагаемых сорбентов и готовых колонок в ком& бинации с эффективными приборами делают возможным быстрое проведение анализов с оптимальной селективностью и высокой чувствительностью. Эти па& раметры можно оптимизировать, варьируя размеры зерна, структуру пор, моди& фицируя сорбенты, размеры колонок и состав элюентов. На практике большин& ство проблем разделения можно решить с помощью небольшого числа сорбен& тов, если используют избирательность элюентов. Но для оптимизации опреде& ленных проблем разделения следует вернуться к модифицированным сорбентам со специфической селективностью, что позволит избежать больших затрат на оп& ределение оптимальных условий разделения.
Большое значение для разделяющей способности колонки имеют размер зер& на и узкое распределение частиц сорбента по размерам. Вообще считается, что частицы с меньших размеров позволяют достичь лучших хроматографических характеристик. Тем не менее, часто, используя частицы несколько больших раз& меров (например, 7 мкм вместо 5 мкм), добиваются приемлемой разделяющей способности колонок при более коротком времени анализов и более продолжи& тельном времени жизни колонки. Еще одну возможность оптимизации представ& ляет применение сорбентов с узким распределением частиц по размерам.
Наряду с узким гранулометрическим составом сорбентов необходимо опти& мальное заполнение ими колонок, и все хроматографические материалы для ВЭЖХ должны быть стабильны к давлению. Готовые колонки, полученные про& мышленным способом, гарантируют очень высокий стандарт, и поэтому пользо& ватель вряд ли будет самостоятельно заниматься заполнением колонок. Плохое и неравномерное заполнение колонок приводит, кроме всего прочего, к образова& нию каналов в структуре слоя сорбента, к его проседанию и т.д. Образующийся
4.5. Колонки для ВЭЖХ 189
вследствие этого мертвый объем значительно ухудшает эффективность разделе& ния или делает колонку непригодной.
В соответствии с используемыми сорбентами методы разделения подразделя& ют на:
•нормальнофазовую хроматографию (адсорбционная хроматография),
•обращеннофазовую хроматографию,
•эксклюзионную хроматографию.
За исключением эксклюзионной хроматографии эффект разделения в жид& костной хроматографии основывается на разной полярности стационарной и под& вижной фазы.
4.5.1.Нормальнофазовая хроматография
Вкачестве материала для заполнения колонки используют силикагели или окси& ды алюминия. Если рассматривают силикагель, то подразумевают, что матрица содержит свободные силанольные группы и, таким образом, является полярной фазой. Поверхностные силанольные группы «активны» и вступают с разделяе& мыми компонентами в диполь&дипольные взаимодействия (адсорбция). Так как стационарная фаза здесь полярная, подвижная фаза должна быть неполярная. Эти условия показаны на рис. 4.15. Молекулы пробы могут находиться как в поляр& ной стационарной фазе, так и в неполярной подвижной фазе. Если молекула об& ладает полярными и, одновременно, неполярными частями, она ориентируется
Полярная |
Неполярная |
стационарная фаза |
подвижная фаза |
Полярное Непо>лярное
Проба |
Элюент |
Колонка
Рис. 4.15. Нормальнофазовая хроматография