Бёккер_Хроматография [2009]

240 Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография

Поток пробы

Насос 2

Дозирующая петля

Рис. 4.36. Схема колонок в процессной ВЭЖХ

ния двух колонок и вырезания анализируемых фракций, как это представлено на рис. 4.36.

Возможные области применения производственной ВЭЖХ – это химическая промышленность, в частности, производство пластмасс, лаков, смягчителей, де& тергентов; биохимическое или фармацевтическое производство, например, про& изводство антибиотиков, гормонов, витаминов и сахаров; анализ воды на пести& циды, анионы и тяжелые металлы; производство полупроводников (анализ вы& зывающих коррозию анионов); анализ на электростанциях качества пара и кон& денсата, ингибиторов коррозии, полноты удаления серы и азота из дыма на стадии промывки; а также гальваническая, бумажная и пищевая промышленность. Пе& речисление областей применения показывает, что в промышленной ВЭЖХ важ& ная роль принадлежит ионной хроматографии. Можно ожидать, что ввиду увели& чения количества задач по контролю и управлению процессами, происходящими в окружающей нас среде, ВЭЖХ наряду с ГХ займет свое место в промышленном анализе.

4.9. Миниатюризация ВЭЖХ

Сегодня стремление к миниатюризации наблюдается повсюду, где по условиям поставленной аналитической задачи в распоряжении имеются слишком малые количества проб, которые нельзя разделить с помощью обычной ВЭЖХ, или там, где важное значение приобретают экономия подвижной фазы и сокращение под& лежащих утилизации отходов [4.37]. Эта технология «уменьшенного размера» се& годня больше не является исключительно элитной техникой, а находит широкое

4.9. Миниатюризация ВЭЖХ 241

Таблица 4.5. Различные колонки для ВЭЖХ

применение в исследованиях и рутинной работе, что связано, с одной стороны, с коммерческой доступностью высокоэффективных хроматографических колонок,

ас другой – с заметным прогрессом в приборостроении [4.38].

Взависимости от внутреннего диаметра используемых хроматографических колонок ВЭЖХ подразделяют на несколько областей, которые представлены в табл. 4.5.

Под ЖХ с колонками большого диаметра подразумевают сегодня «стандарт& ную» ЖХ с внутренним диаметром колонок от 2 до 5 мм. Наполненные микроко& лонки и капиллярные колонки сегодня доступны коммерчески, тогда как полые капиллярные колонки, которые издавна успешно использовали в ГХ, находятся в стадии разработки.

Для миниатюризации ВЭЖХ нужны приборы с предельно малыми мертвыми объемами и минимальным внеколоночным размыванием пиков. Все компонен& ты системы должны иметь микроразмеры. Насос должен прокачивать микропо& токи точно и без пульсаций. Особое внимание нужно обращать при этом на гра& диентное элюирование, так как при столь малых мертвых объемах, необходимых для микроколонок, объемы обычного смесителя и насоса слишком велики. Сис& тема ввода пробы должна быть предназначена специально для ввода минималь& ного объема пробы, причем автоматизация способствует экономии времени и финансовых затрат. Решающая роль для эффективности и чувствительности оп& ределения играют тип и качество детектора.

4.9.1. Микроколоночная техника

Микроколоночная техника для ВЭЖХ уже давно находится в поле зрения произво& дителей и пользователей. В последние годы благодаря интенсивным исследовани& ям она достигла больших успехов и начинает использоваться как рутинный метод в лабораториях. Микроколоночная хроматография не является новым достижением в области ЖХ, и еще в 1969 году было описано применение колонок диаметром 1 мм, которые оозначались как «колонки малого диаметра» [4.39]. Сегодня колон& ки с диаметром 1 мм и меньше обычно обозначают как микроколонки, и соответ& ственно этому введено название «микроколоночная хроматография» [4.40].

То, что повышенный интерес к этой новой технике стали проявлять только в последнее время, объясняется многими факторами. С одной стороны, нужно было преодолеть в трудности приборостроении, и, с другой стороны, техника получе& ния колонок также была развита недостаточно, чтобы способствовать прорыву

242 Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография

этого нового метода. Вначале микроколонки заполнялись 10& и 20&микронными частицами, длина колонки составляла до 100 см, а внутренний диаметр выбирал& ся между 1,0 и 1,5 мм. С этими трудностями удалось справиться в течение после& дних лет. Что касается техники получения колонок, то наряду с колонками диа& метром 4,6 мм наиболее распространенные стационарные фазы стали также ком& мерчески доступны в виде колонок диаметром 1 и 2 мм. Сегодня микроколонки можно заполнять так же хорошо и воспроизводимо, как и стандартные колонки. С определенного времени и инструментальная база для микро ВЭЖХ перестала быть проблемой.

Насосы позволяют пользователю работать с постоянным потоком в области от 10 до 100 мкл/мин, чтобы использовать микроколонки в оптимальном режиме. Такие низкие скорости потока ведут к определенным особенностям и с любой точки зрения требуют специального исполнения хроматографической системы. Если хотят полностью использовать преимущества микроколоночного метода, то, конечно, надо персмотреть все параметры (поток, форму градиента, длину коло& нок). Прежде всего, при переходе к колонкам с внутренним диаметром 1 мм не& обходимо изменить соответствующим образом приборное оснащение, например, использовать детекторы с микроячееками. В то время как стандартные детекторы обладают объемом ячейки от 3 до 12 мкл, микроколоночные детекторы требуют объем ячейки от 0,8 до 3 мкл. Кроме того, больше нельзя использовать градиент низкого давления, и из&за малых скоростей потоков смешение должно происхо& дить на стороне высокого давления.

4.9.1.1. Преимущества микроколоночной хроматографии

Первым и общим преимуществом применениия микроколоночной техники яв& ляется возможность экономии зачастую дорогих растворителей, которое выте& кает из соотношения квадратов диаметров колонок. При переходе от скоростей потока 0,5–2 мл/мин, используемых в стандартной ВЭЖХ, к скоростям потока 10–50 мкл/мин, используемых в микроВЭЖХ, достигается 10& –200&кратная эко& номия растворителя. Это важно, прежде всего, там, где нужно работать с дороги& ми растворителями или проводить очень много анализов. Кроме того, утилиза& ция меньших количеств растворителей всегда благоприятна с точки зрения защи& ты окружающей среды.

Объемы проб для микроколонки в 10–50 раз меньше, чем для стандартных колонок. Это, например, представляет интерес при анализе биоматериала, где в распоряжении часто имеется ограниченное количество пробы. Преимуществом является также возможность достигать очень большого числа теоретических та& релок и, благодаря этому, разделять очень сложные смеси. Отличительная черта микроколонок – это возможность объединять их в серии, то есть подключать друг к другу. Число теоретических тарелок такой серии складывается из чисела таре& лок для каждой отдельной колонки [4.41].

Зависимость ширины пика от скорости потока может быть, как известно, вы& ражена уравнением Ван&Деемтера, которое ранее было получено в ГХ, но спра& ведливо также и для ЖХ. Из него следует, что малая высота тарелки достигается при использовании частиц, имеющих малый диаметр. Уменьшение размеров час&

4.9. Миниатюризация ВЭЖХ 243

тиц, все же, имеет практические границы, так перепад давления на колонке рас& тет с уменьшением диаметра частиц и могут проявляться негативные эффекты, как, например, температурные эффекты или нестабильность материала сорбента. Поскольку в микроВЭЖХ используются более низкие скорости потока, то это по& зволяет использовать более мелкие частицы при сохранении приемлемого дав& ления, причем возможно рутинное применение колонок с частицами от 1 до 2 мкм.

Следующим преимуществом микроВЭЖХ является более высокая чувстви& тельность, обеспечиваемая микроколонками по сравнению со стандартными ко& лонками диаметром 4,6 мм. Улучшенние пределов обнаружения вытекает из уменьшения объема элюируемых пиков. Теоретически объемы пиков уменьша& ются пропорционально первой степени длины колонки и квадрату ее диаметра. Таким образом, сравнивая две колонки с одинаковой стационарной фазой и оди& наковой длины при переходе от колонок с диаметром 4,6 мм к колонкам диамет& ром 1 мм, объем уменьшится в (4,6 : 1)2 = 21,16 раза. Так что при одинаковых количествах пробы ее концентрация в пике должна вырасти с учетом этого фак& тора в 21,16 раза. На практике, тем не менее, наблюдаются несколько меньшие величины, так как, прежде всего, в микроВЭЖХ очень сильно проявляются эф& фекты, которые приводят к внеколоночному уширению пиков. Очень важно, по& этому, все соединения между инжектором и колонкой, а также между колонкой и детектором делать предельно короткими.

Чтобы полностью использовать преимущества микроколонок, необходимо тщательно обдумывать процесс хроматографии. С чисто хроматографической точ& ки зрения, большое преимущество микроколонок состоит в возможности того, что можно легко переходить от высокого разрешения к высокой скорости потока и наоборот. Высокая скорость потока означает, как правило, короткое время ана& лиза и далеко неидеальное разрешение. Низкие скорости потока приводят к дли& тельным временам анализа и высокой разрешающей способности системы. Как правило, нельзя добиться одновременно высокой скорости и высокого разреше& ния [4.42].

Использование длинных микроколонок в жидкостной хроматографии, ко& торое в большинстве случаев удлиняет время анализа (описаны примеры от 3 до 20 часов!), может быть оправдано только в работе со сложными смесями, а также в системах, где требуется очень высокая эффективность разделения и, как след& ствие этого, приходится мириться с длительным временем анализа. С другой сто& роны, было показано, что может быть разработан микроколоночный метод, рас& считанный на предельно короткое время анализа в сочетании с высокой чувстви& тельностью. Описаны примеры разделения, которые длятся всего 20–30 секунд.

4.9.2. Капиллярная ЖХ

Капиллярная ЖХ является вместе с микроколоночной хроматографией дальней& шим развитием ВЭЖХ в направлении миниатюризации. Капиллярные колонки для ЖХ делают из кварцевых капилляров и имеют внутренний диаметр 320 мкм при длине 25 см. Их наполняют силикагелем для нормальной или обращенно& фазовой хроматографии, имеющим сферическую или неправильную форму. Пре&

244 Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография

Кран>дозатор

Т>образный переходник

Насос

Рестриктор

Микро> ЖХ колонка

Обратный поток

Детектор

Рис. 4.37. Устройство капиллярной ЖХ системы

имущество капиллярной ЖХ вытекает из предельно малого внутреннего диамет& ра колонки и, соответственно, минимальной дисперсии пика. Полная капилляр& ная ЖХ система состоит из насоса, инжектора, колонки и соответствующего де& тектора.

Поток в капиллярной ЖХ обычно лежит между 3 и 10 мкл/мин. Для таких потоков лучше всего подходят микрошприцевые насосы, обеспечивающие малень& кие скорости потоков, хотя могут применяться и обычные ЖХ насосы, если их снабжают делителем потока. Рис. 4.37 показывает деление потока растворителей с помощью Т&образного переходника, не имеющего мертвого объема, и рестрик& тора.

Проба подается на колонку с помощью обычного крана&дозатора, снабжен& ного петлей объемом от 60 до 1000 нл. Применения, которые были разработаны для обычных ЖХ колонок, можно также без труда перенести на микроЖХ колон& ки, так как в обоих случаях природа стационарной и подвижной фаз одна и та же.

4.9.2.1. Преимущества капиллярной ЖХ

Из&за стабильной, но все же менее плотной упаковки капиллярные колонки по& казывают в 1,5–2 раза более высокую проницаемость, чем обычные колонки. Поэтому колонки приемлемой длины могут наполняться частицами с меньшим размером зерна от 1 до 2 мкм без превышения предельных давлений, допустимых для используемых приборов. С другой стороны, колонки с высоким разрешением могут быть получены заполнением колонок длиной в несколько метров сорбен& тами с большим диаметром частиц (от 5 до 10 мкм).

Чувствительность концентрационнозависимых детекторов, таких как УФ, флуоресцентные, рефрактометрические и электрохимические детекторы, пропор& циональна концентрации в максимуме пика. Эта концентрация растет с умень& шением диаметра колонок. Поэтому уменьшение стандартного внутреннего диа&

246 Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография

ку вдоль оптической оси детектора. Длина оптического пути составляет 2 см, вслед& ствие чего чувствительность обнаружения выше в 100–500 раз, чем при верти& кальных ячейках. Несмотря на большую длину пути общий объем ячейки состав& ляет только 90 нл.

Низкие скорости потоков позволяют непосредственно комбинировать капил& лярную ЖХ с масс&спектрометрией. Нет необходимости использовать делитель потока, что, конечно, повышает чувствительность метода. Определенно, этот вид комбинации ЖХ&МС открывает фантастические возможности.

Благодаря меньшему диаметру капиллярных ВЭЖХ колонок по сравнению с обычными колонками расход растворителей уменьшается. Обычные объемные скорости насосов в капиллярной ЖХ составляют от 3 до 6 мкл/мин. Насос рабо& тает по так называемому принципу шприца. Объем цилиндра насосов составляет около 50 мл, т.е. одного наполнения насоса достаточно, чтобы в течение пример& но четырех недель проводить точные анализы, при этом подача растворителя сво& бодна от пульсаций.

Малые объемы колонок обуславливают малые объемы элюирования. Пики выходят – при правильном устройстве прибора – более узкими и высокими. Это означает заметное улучшение пределов обнаружения. Поэтому капиллярная ЖХ отвечает запросам тех, кто должен обходиться самыми небольшими количества& ми пробы. Это касается, прежде всего, аналитиков, работающих в областях био& химии и биотехнологии, токсикологии и судебной химии, а также медицины.

При типичном объеме проб от 60 до 90 нл разделения на капиллярных колон& ках происходят предельно быстро (в частности, за секунды) и при том с высокой чувствительностью.

4.9.2.2. Системные ошибки микрометода

Решающим для элюирования какой&либо части пробы с колонки является – при прочих постоянных условиях – не время удерживания, а объем удерживания, во всяком случае, до тех пор, пока в колонке сохраняется ламинарный поток, или, точнее, до тех пор, пока скорость потока находится в области кривой Ван&Деем& тера, в которой можно ожидать качественно хороших результатов разделения. Если, однако, специфический для вещества объем удержания является достаточ& ным для идентификации неизвестных фракций пробы при прочих постоянных условиях (однако, переменных скоростях потока!), тогда требование постоянства потока в детекторе для получения воспроизводимых времен удержания представ& ляет собой особый случай, когда от этого требования с целью возможного упро& щения прибора можно отказаться.

С уменьшением диаметра колонки становится все труднее добиться постоян& ства потока в детекторе. С технической точки зрения, более высокое механичес& кое сопротивление потоку в узких колонках между насосом и детектором действует как непостоянное демпфирующее устройство. Обыкновенные хроматографичес& кие насосы (система с коротким ходом поршня) оказываются неспособными со& здать поток с малой объемной скоростью, что обусловлено неравномерностью по& дачи элюента в нижней области скоростей потока. Кроме того, результатом пуль& саций у этих возвратно&поступательных насосов является более высокий шум при

248 Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография

писцу. Совершенно свободную от пульсаций подачу элюента осуществляют насо& сы с длинным ходом поршней, которые выполнены в форме тандемного насоса (т.е. насоса с двойным поршнем), чтобы обеспечить неограниченную подачу ра& створителя. Движушийся вперед поршень шприцевого насоса постоянно враща& ется, вследствие чего между поршнем и уплотнением поршня постоянно сохра& няется трение скольжения и не возникает время от времени трение сцепления. Система дополнительно компенсирует даже самые небольшие механические ошибки трансмиссии и шпинделя непосредственным измерением тяги шпинде& ля в аксиальном направлении с предельно высоким разрешением 0,5 мкм. Быст& рое обратное регулирование путем сравнения величин «задано/получено» после каждых 0,025 мкл прокаченного объема гарантирует синхронность заданного и фактического градиента и свободный выбор программы градиента.

Если во время анализа возникают колебания давления, то могут появляться постепенные отклонения градиента, которые связаны с разной сжимаемостью компонентов элюента и изменяющимся соотношенем компонентов в смеси во время анализа. Поэтому при градиентном элюировании работают с точно регули& руемым постоянным давлением, пренебрегая при этом наблюдаемыми колеба& ниями скорости потока.

4.10. Препаративная ВЭЖХ

Препаративная ВЭЖХ из&за своих размеров представляет другую крайность в срав& нении с микроВЭЖХ и обозначается так же, как препаративная жидкостная хро& матография под давленем. Эффективность ВЭЖХ при выделении одного или не& скольких компонентов из сложной смеси объясняет растущее значение препара& тивного метода как метода очистки. Препаративная ВЭЖХ отличается от ее ана& литического аналога, прежде всего, по своим задачам.

Цель препаративной хроматографии – это сбор фракций выделенных чистых продуктов или получение предочищенных промежуточных продуктов. Препара& тивная ВЭЖХ вступает в действие, если классические методы разделения, пере& гонка, кристаллизация и т.д. не ведут к желаемому успеху. Очистка продуктов ча& сто применяется в биологии и биохимии, тогда как выделение продукта прово& дится преимущественно в препаративной химии. Для этого имеется автоматичес& ки работающая препаративная система ВЭЖХ с подходящими коллекторами фракций, которые управляются по сигналу детектора и собирают нужные чистые фракции в специальные контейнеры [4.44].

Все чаще ставится проблема выделения высокоочищенных реагентов из сме& сей продуктов синтеза или экстрактов природных материалов. Тем не менее, преж& де чем приступить к выделению, следует сначала аналитически идентифициро& вать интересующее вещество в исходной пробе сложного состава. Затем, после успешного аналитического разделения, должно проводиться разделение на грам& мовом или даже килограммовом уровне, что часто приводит к новым проблемам. Отработанные при аналитическом разделении хроматографические условия дол& жны быть адаптированы к обычным для препаративных разделений большим ди& аметрам колонок и высоким скоростям потоков [4.45].

4.10. Препаративная ВЭЖХ 249

При препаративном разделении в первую очередь необходима высокая нагру& зочная емкость колонки, т.е. возможность разделения возможно большего количе& ства пробы за один цикл. Так как с помощью автоматических коллекторов фракций процесс можно проводить и ночью, то временные затраты на разделение имеют второстепенное значение. Высокие скорости потоков с соответственно большими количествами пробы можно часто достичь только тогда, когда используются ста& ционарные фазы с большим диаметром частиц. Так как при этом требуется не такое высокое давление, как при аналитическом разделении, то в большинстве случаев используются компоненты приборов для жидкостной хроматографии низкого дав& ления (ЖХНД) [4.46]. Эти колонки, однако, обладают меньшим числом тарелок и более низким разрешением. На практике разделения часто приходится проводить в неоптимальных условиях, например, из&за низкой растворимости пробы или не& совместимости растворителей, оптимальных для хроматографии, с последующими этапами работы с выделенным продуктом.

Разработка препаративного метода разделения в значительной степени свя& зана с экономической эффективностью. Из&за размеров колонки все большее зна& чение приобретают расходы на растворитель и сорбент. Целью препаративного разделения является выделение желаемого продукта с определенной степенью чистоты в максимальном количестве и за минимальное время. Для достижения максимальной производительности препаративные колонки часто перегружают. В этом случае, учитывая количество и объем вещества, колонка больше не рабо& тает в оптимальном режиме, и разрешение снижается. При этом в большинстве случаев, чисто эмпирически, увеличивают объем вводимой пробы до тех пор, пока разделенные пики не начинают сливаться.

Если хотят повысить нагрузку, сохранив эффективность разделения, то будет разумно увеличить размер зерна носителя и длину колонки, причем длина колон& ки должна увеличиваться пропорционально квадрату отношения диаметров час& тиц. При этом, как благоприятный побочный эффект, также квадратично отно& шению диаметров частиц увеличиватся и проницаемость колонки, и, соответ& ственно, квадратично снижается давление на колонке.

Так как успешное разделение может быть уничтожено неправильным управ& лением системой, то следует уделить внимание надежной работе коллектора фрак& ций, особенно если он работает круглосуточно. Все нарушения должны детекти& роваться системой, и отдельные фракции, соответственно, должны удаляться из системы. Чтобы хроматографическое разделение можно было проводить в авто& матическом режиме, его нужно оптимизировать таким образом, что хроматограм& мы при повторных вводах пробы будут мало отличаться друг от друга [4.47].

При переходе от успешного аналитического разделения к препаративным мас& штабам необходимо, чтобы стационарная фаза, используемая в препаративном раз& делении, отличалась как можно меньше от той фазы, которая использовалась в ана& литическом разделении. Подвижная фаза должна как можно проще отделяться от сорбатов, для чего, как правило, используется роторный испаритель. В качестве материала колонок подходят устойчивые к давлению стеклянные колонки, кото& рые могут выдерживать давление до 100 атм и пользователь может наполнять их всеми коммерчески доступными стационарными фазами [4.48].