Бёккер_Хроматография [2009]

200 Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография

Рис. 4.21. Эксклюзионная хроматограмма олигомеров стирола

меру молекулы, а не ее массе, это сравнение верно только для молекул одного и того же вида в одинаковом растворителе. Причина заключается в том, что в этом хроматографическом методе разделение происходит соответственно гидродинами& ческому объему, а не молекулярной массе. Поэтому для неизвестных веществ моле& кулярная масса может быть определена только с известными ограничениями.

Существует возможность пересчитать калибровочную кривую для наиболее часто используемых полистирольных стандартов на калибровочную кривую для других полимеров, но если нужно определять молекулярные веса, то все же луч& ше всего калибровать колонку со стандартом, химическая природа которого воз& можно больше походит на свойства пробы. Одна и та же молекула может иметь разную величину в различных растворителях и элюироваться, таким образом, с разной скоростью. Клубковая молекула может набухать или сжиматься. Также молекула может быть сольватирована в растворителе и казаться вследствие этого больше, чем есть на самом деле. Для точного определения молекулярного веса с помощью эксклюзионной хроматографии есть детектор, чувствительный к моле& кулярной массе, который работает на принципе малоуглового лазерного свето& рассеяния [4.9].

Определения молекулярных масс и распределений молекулярных масс с помощью гельпроникающей хроматографии просты и быстры. Так как они опи& раются, однако, исключительно на объемы элюирования, то объемы должены определяться с большой точностью. Подвижная и стационарная фазы в экск& люзионной хроматографии должны удовлетворять только трем требованиям, а именно:

•подвижная фаза должна быть хорошим растворителем для пробы;

•проба не должна вступать ни в какие взаимодействия со стационарной фазой;

•подвижная фаза не должна разрушать стационарную фазу.

4.6. Выбор методов ВЭЖХ%анализа 201

Если эти три условия выполнены, то эксклюзионная хроматография – это от& носительно безпроблемный, простой, широко применимый и быстрый метод раз& деления [4.10]. Разумеется, для подвижных фаз следует вводить ограничения. В гель& проникающей хроматографии с органическими растворителями используется сти& ролдивинильный сополимер, который в некоторых случаях может набухать или сжиматься. Силикагель хуже подходит для ГПХ из&за его адсорбционных свойств. В гельфильтрации, наоборот, используют гидрофильные гели, такие как полиакри& ламиды, полисахариды, метакрилаты и т.д., которые обладают очень незначительной механической прочностью. Они сильно склонны к набуханию или сжатию. Здесь предпочтительнее использовать химически модифицированный силикагель.

В эксклюзионной хроматографии величина пор стационарной фазы должна соответствовать гидродинамическому размеру молекулы в растворе. Доступны стационарные фазы с величинами пор от 100 до 106 ангстрем. Это позволяет пере& крыть примерно такой же диапазон молекулярных масс. Теперь остается только выбрать стационарную фазу и элюент, но таким образом, чтобы не было никаких адсорбционных взаимодействий, то есть поверхность стационарной фазы по по& лярности и химической структуре должна быть похожа на элюент и хроматогра& фируемые вещества. С помощью эксклюзионной хроматографии на крупнопо& ристом носителе можно также проводить препаративные разделения [4.11].

Хотя эксклюзионная хроматография разрабатывалась для задач полимерной химии, она оказалась полезным, позволяющим сэкономить время методом и при решении других проблем разделения. Этот метод все чаще применяется в после& довательном анализе сложных смесей в пищевой промышленности, экологичес& кой аналитике и фармацевтической индустрии. Фракции пробы, собранные при эксклюзионной хроматографии, можно анализировать затем другими физичес& кими или химическими методами.

4.6. Выбор методов ВЭЖХ анализа

Три сегмента – пробоподготовка, хроматографическое разделение и детектиро& вание – следует рассматривать как тесно связанные друг с другом и поэтому все& гда взаимозависимые и соответствующие данной аналитической проблеме. Боль& шое разнообразие методов разделения, многочисленные методы детектирования и широкая автоматизация всех этапов анализа являются основой точных и эко& номичных анализов [4.12].

4.6.1. Пробоподготовка

Первый шаг пробоподготовки состоит в большинстве случаев в том, чтобы пере& вести все анализируемые вещества, которые содержатся в пробе, в раствор. Для растворения или экстракции должен использоваться растворитель, в котором ис& следуемые вещества обладают особенно хорошей растворимостью, чтобы гаран& тировать полноту извлечения.

Однако поскольку при этом растворяются и многие другие вещества веществ, то эту «первичную пробу» во многих случаях нельзя использовать непосредствен&

202 Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография

но для ВЭЖХ анализа. Загрязнение колонки из&за адсорбции сторонних компо& нентов и, как следствие этого, изменение хроматографического поведения ко& лонки, например, смещение времен удерживания, делают невозможным воспро& изводимый анализ. Отделение матрицы может происходить разными способами. Иногда проблему решают использование предколонки и ее регулярная замена. Тем не менее, часто при пробоподготовке необходимо вводить дополнительную стадию отделения матрицы. Здесь помогает специфическая экстракция анализи& руемых веществ из первоначальной пробы.

Экстракция, согласно общепринятой точке зрения, может происходить при распределении вещества между двумя жидкими фазами. С другой стороны, хрома& тографический метод, а именно экстракция целевых компонентов твердой фазой из жидкости с их адсорбцией на твердой фазе, которая в большинстве случаев по& добна хроматографической фазе, и последующая десорбция, лучше подходят для дальнейшего разделения. Твердофазную экстракцию (ТФЭ, Solid phase extraction, SPE) невозможно больше отделить от современной аналитики. Удаление мешаю& щей матрицы или концентрирование следовых компонентов пробы часто необ& ходимо, чтобы либо избежать перекрывания пиков, либо повысить слишком низ& кую концентрацию следового компонента.

Для определении следовых количеств вещества в водной пробе с использова& нием ТФЭ большие объемы водной пробы подают на колонку. Затем пробу элюи& руют небольшим количеством растворителя. Из&за малого потребления раство& рителя, невысоких временных затрат и прекрасной эффективности экстракции при методической простоте твердофазная экстракция все больше вытесняет обыч& ную жидкость&жидкостную экстракцию. Таким образом, становится возможным «вырезать» из смеси вещества, сходные по своей полярности. Подходящие для ТФЭ «мини&колоночки» предлагаются в настоящее время несколькими фирма& ми. Эту технику можно автоматизировать с помощью системы переключения ко& лонок.

При разделении неподготовленных растворов проб рекомендуется использо& вать короткую предколонку, которую необходимо часто менять. Таким образом, можно значительно продлить жизнь аналитической хроматографической колон& ки. Предколонки содержат тот же сорбент, который используется в аналитичес& кой колонке. Тем не менее, они не должны вызывать предварительное разделение пробы, а должны удерживать компоненты пробы или ингредиенты раствора с высоким k ′. Недостатком предколонки является то, что пики становятся шире за счет прохождения дополнительного пути через слой сорбента.

4.6.2. Хроматографическое разделение

Для выбора условий разделения необходимо знать, прежде всего, химические и физические свойства анализируемой смеси веществ. Стационарная и подвижная фазы для разделения должны соответствовать химической структуре, полярнос& ти, растворимости, функциональным группам и молекулярному весу веществ в анализируемой смеси. Основываясь на этих данных, разделение можно прово& дить согласно химическому различию анализируемых веществ или различию в

4.6. Выбор методов ВЭЖХ%анализа 203

молекулярных массах. В общем случае, целесообразно провести литературный поиск, чтобы найти конкретные указания о возможных условиях разделения.

Разделение по химическим свойствам основывается на химических законах об адсорбции и/или распределения. Главными здесь являются три параметра – вещество, элюент и стационарная фаза. Элюент и стационарную фазу нужно вы& бирать соответственно полярности смеси веществ. Здесь действуют следующие правила:

Неполярное вещество требует неполярного элюента и полярной стационарной фазы.

Этот подход называется нормальнофазовой хроматографией. Противополож& ностью ему является метод, который называют обращеннофазовой хроматогра& фией:

Полярное вещество требует полярного элюента и неполярной стационарной фазы.

Различия в полярности анализируемых компонентов смеси определяют, дол& жен ли анализ быть изократическим или происходить с градиентом элюента. Эф& фективность разделения растет с уменьшением диаметра частиц материала, за& полняющего колонку. Эффективность колонок, заполненных частицами разме& ром 3 мкм, очень высока, и число теоретических тарелок достигает от 100 000 до 125 000 на метр длины колонки. С этим связано, однако, высокое давление, необ& ходимое для подачи подвижной фазы. Поэтому для частиц такого размера нужно рекомендовать колонки не стандартной длины 25 см, а более короткие колонки длиной 10 см.

4.6.2.1. Условия нормальнофазовой хроматографии

Хроматографическое разделение на силикагеле или оксиде алюминия как стацио& нарной фазе происходит вследствие адсорбции. У силикагеля активные места – это силанольные группы (–Si–OH), у оксида алюминия это, прежде всего, Al3+ цент& ры, но также и связанные O2– атомы. Они создают некий вид слабой «связи» с каж& дой молекулой, находящейся поблизости, если возможно одно из следующих взаи& модействий:

•диполь& индуцированный диполь,

•диполь&диполь,

•образование водородных мостиков и

•образование π&комплексов.

Эта возможность существует, если молекула обладает одним или несколькими атомами с неподеленной свободной парой электронов или содержит двойную связь для образования π&комплекса; так называемую другими словами, если молекула содержит так называемую функциональную группу или кратные связи. Напротив, алканы едва ли могут взаимодействовать, так как они насыщены и состоят только из атомов C и атомов Н, которые не имеют свободных электронных пар. Если у молекулы есть несколько функциональных групп, то за удерживание отвечает наи& более полярная группа. Базируясь на этой концепции, можно сделать три вывода:

204 Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография

•силикагель в хроматографической колонке со всех сторон окружен подвиж& ной фазой. Растворитель более или менее прочно сорбирован на всех ак& тивных центрах. Молекула пробы может адсорбироваться на поверхности силикагеля, только если взаимодействие сорбента с ней сильнее, чем его взаимодействаие с растворителем;

•все молекулы пробы и, естественно, молекулы растворителя ориентирова& ны на поверхности силикагеля таким образом, что их функциональные груп& пы или двойные связи находятся вблизи силанольных групп. Имеющиеся в молекулах углеводородные фрагменты направлены в сторону от поверхно& сти силикагеля. Поэтому сорбент не может дифференцировать молекулы, которые отличаются только алифатическим радикалом. Смесь бутанола, пентанола и октанола нельзя хорошо разделить адсорбционной хроматог& рафией;

•сила взаимодействия сорбата с сорбентом зависит не только от функцио& нальных групп молекул пробы, но и от пространственных факторов. Моле& кулы, которые отличаются трехмерной структурой, т.е. стереоизомеры, мож& но хорошо разделять с помощью адсорбционной хроматографии.

Из первого вышеупомянутого заключения ясно, что не каждый растворитель элюирует молекулы пробы мгновенно и быстро. Если подвижная фаза – это али& фатический углеводород, например, гексан, то он может плохо вытеснять моле& кулы пробы с активных мест сорбента. Такой растворитель называют слабым. Напротив, метиленхлорид – это сильный конкурент за активные центры, так что молекулы пробы меньше времени остаются адсорбированными и будут быстро элюированы. Этот растворитель называют относительно сильным.

ЭЛЮОТРОПНЫЙ РЯД

Эта сила элюирования или вытесняющая сила различных растворителей опреде& лялась эмпирически и принималась как числовое значение, обозначаемое сим& волом E0. Такую последовательность, найденную для слабых, средних и сильных растворителей, называют элюотропный ряд. Оказывается, что элюенты упорядо& чены согласно своей полярности. В адсорбционной хроматографии сильный ра& створитель является полярным, а слабый – неполярным.

Втабл. 4.3 для сорбента оксида алюминия указаны значения E0, которые не& сильно отличаются и для силикагеля. Последовательность растворителей не ме& няется при переходе от оксида алюминия к силикагелю.

Вкачестве подвижной фазы в адсорбционной хроматографии используют ра& створители из неполярной части элюотропного ряда, то есть от н&пентана до эти& ленхлорида. Более полярные, чем диоксан, элюенты использовать не имеет смыс& ла, так как они очень сильно адсорбируются и, как следствие, образуется скорее жидкость&жидкостная распределительная система. Из предосторожности снача&

ла используют наиболее сильный растворитель, чтобы гарантированно элюиро& вать пробу. Если полученные значения k ′ слишком малы, то переходят к несколь&

ко более слабому растворителю, который элюирует компоненты пробы с опти& мальными факторами удерживания между 1 и 5, а для сложных смесей – до 10.

206 Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография

Если при проверке проба при элюировании гексаном идет вместе с фронтом или же она не элюируется диоксаном, то разделение методом адсорбционной хро& матографии такой пробы невозможно. Можно попытаться разделить ее на обра& щенной фазе или ионобменной хроматографией.

4.6.2.2.Условия обращеннофазовой хроматографии

Охроматографии на обращенной фазы говорят всегда в том случае, когда стаци& онарная фаза менее полярна, чем подвижная фаза. Хроматография с обращением фаз может быть отнесена с вескими основаниями либо к адсорбционной хрома& тографии, либо к распределительной хроматографии. Чаще всего применяемая стационарная фаза – это химически привитой на поверхность силикагеля окта& децилсилан ОДС, нормальный алкан с 18 атомами C. Используются, однако, C8& и более короткие алкильные цепи, а также циклогексановые& и фенильные груп& пы. Фенильные остатки несколько более полярны, чем алкильные группы.

Вещества пробы тем сильнее удерживаются обращеннофазовым сорбентом, чем меньше они растворимы в воде, т.е., чем более они неполярны. Чаще всего используются смеси воды и метанола. Почти все пробы элюируются между 10% и 90% метанола или ацетонитрила в воде. Это выгодно также в финансовом отно& шении, так как вода «бесплатна» (все же это должен быть бидистиллят), а мета& нол – один из самых дешевых растворителей. К сожалению, у смесей воды и ме& танола действительно высокий максимум вязкости, так что при работе с ними обычно требуется гораздо более высокое давление, чем для других подвижных фаз.

Смеси ацетонитрила и воды также часто используются, и это хорошая альтер& натива водно&метанольной системе, так как ацетонитрил в отличие от метанола является апротонным растворителем и проявляет, таким образом, другую изби&

рательность. Проблематична большая токсичность ацетонитрила (CH3–CN), так что точно необходимо позаботиться о его регенерации с помощью дистилляции.

Вобращеннофазовой хроматографии часто применяются водные растворы проб, которые могут содержать ионогенные материалы. Ионные вещества пробы не задерживаются обращеннофазовой колонкой; они лучше всего делятся с по& мощью ионообменной или ионпарной хроматографии. Все же обращеннофазо& вая хроматография возможна, если смесь содержит, наряду с нейтральными ве& ществами, либо только слабую кислоту, либо только слабое основание. В первом случае подвижная фаза закисляется, во втором случае – защелачивается. Про& блемные компоненты пробы находятся тогда в недиссоциированной форме и, со& ответственно, удерживаются колонкой.

ПРЕИМУЩЕСТВА ОБРАЩЕННОФАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

На обращенной фазе можно разделять как полярные, так и совсем неполярные вещества, а следовательно, также и среднеполярные компоненты. Установление равновесия между подвижной и стационарной фазами происходит быстро, так что без проблем может проводиться градиентное элюирование. Водные растворы проб намного чаще встречаются в аналитике, чем пробы в органических раство& рителях. Например, биологические соки, напитки, гальванические ванны и т.д. представляют собой водные растворы. Так как вода – это самый слабый элюент,

208 Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография

Вода

Тетрагидрофуран

Ацетонитрил

Метанол

Рис. 4.22. Диаграмма смесей растворителей

комбинации этих растворителей можно описать как тетраэдр, как это представ& лено на рис. 4.22. Четыре вершины дают положение четырех чистых растворите& лей, ребра представляют бинарные, грани – тройные и пространство внутри тет& раэдра – четверные смеси. В пределах тетраэдра можно определить плоскость, которая связывает друг с другом различные составы мобильной фазы, обладаю& щие одной и той же элюотропной силой, и, таким образом, определить изоэлю& отропную поверхность (составов подвижной фазы), для которой средняя величи& на k ′ одинакова, но селективность различна. Программное обеспечение помогает пользователю затем найти ту поверхность, которая лучше всего подходит для ис& следуемой пробы.

Вначале, используя градиент от воды или буфера к метанолу, определяют об& ласть (состава элюентов), обеспечивающих подходящий дипазон времен удержи& вания. На основании этих времен удерживания предсказывается состав смеси метанол/вода или метанол/буфер, которая в изократическом режиме дает прием& лемый диапазон значений k ′ (например, от 0,5 до 10). Составы изоэлюотропных подвижных фаз ацетонитрил/буфер или тетрагидрофуран/буфер могут быть рас& считаны из факторов переноса, которые связывют элюотропную силу этого орга& нического растворителя с метанолом.

Эти три бинарные смеси определяют положение изоэлюотропной поверхно& сти внутри тетраэдра. Пригодность каждой бинарной смеси следует проверять экспериментально, так как используемые факторы переноса являются теорети& ческими величинами и поэтому не универсальны.

Затем проводят идентификацию пиков, моделируют удерживание и предска& зывают оптимальное разделение. В различных точках изоэлюотропной плоско& сти записывают несколько наборов данных, полученных с детектором с диодной матрицей, обрабатывают их и результаты используют для предсказания оптималь& ного разделения. Данные каждого для каждой точки (изоэлюотропной плоскости) оцениваются по тем или иным критериям, и выбирается лучшая хроматограмма.

4.6. Выбор методов ВЭЖХ%анализа 209

Применение «более умных» хемометрических алгоритмов делает возможным разрешение и идентификацию неразделенных пиков. При этом речь идет о про& цессе, похожем на методы усиления изображений, которые применяются при ре& дактировании спутниковых фотографий. Эта техника использует базу данных поглощение–длина волны–время, чтобы найти индивидуальные спектры пиков. Она основана на предположении, что матрица данных формируется из линейной комбинации индивидуальных спектров.

Если индивидуальные спектры известны, то матрицу можно найти относитель& но просто, сложнее выполнить обратную задачу. Суть метода состоит в разложе& нии матрицы данных в произведение трех новых матриц: матрицы абстрактных спек& тров, матрицы абстрактных хроматограмм и диагональной матрицы, содержащей собственные значения. Последняя матрица показывает число имеющихся (на хро& матограмме) компонентов (пики и фоновый режим). Из недиагональных матриц будут сконструированы новые хроматограммы через линейную комбинацию аб& страктных хроматограмм.

Чтобы получать коэффициенты, которые используются для преобразования абстрактных хроматограмм в хроматограммы «наилучшего приближения», исполь& зуется метод итераций, начиная с бесконечно узкого пика в заданном положении. Он используется для расчета коэффициентов, с которыми реконструируется улуч& шенная хроматограмма. После заданного количества итераций компьютер выво& дит лучшие реконструированные хроматограммы и спектры. Этот метод известен как «итерационный целевой факторный анализ» («Iterative target Transformation factor analysis»).

Для каждого пика на референтной хроматограмме подбирается математичес& кая модель, описывающая его время удерживания в различных точках плоскости. Модель дает поверхность времен удерживания, которая описывает движение пи& ков при изменении состава растворителей. Результирующую функцию можно выбирать в зависимости от того, является ли, к примеру, необходимым минималь& ное время анализа или возможно более равномерное распределение пиков на хро& матограмме.

Одно из главных преимуществ этого итеративного процесса состоит в том, что после сбора данных критерии оптимизации можно выбрать и изменить без проведения дополнительных экспериментов. «Теоретические хроматограммы» могут рассчитываться для всех пиков в пробе или только для их части. Таким об& разом, можно оптимизировать разделение только тех компонентов, которые пред& ставляют особенный интерес.

4.6.4. Детектирование

Выбор детектора определяется чувствительностью и избирательностью, необхо& димых для решения аналитической задачи. Чувствительность, в свою очередь, зависит от физико&химических свойств анализируемых веществ – ультрафиоле& товое поглощение, флуоресценция, электрохимический потенциал и показатель преломления. С другой стороны, определенную роль играет и чувствительность самого используемого устройства. Принцип измерения, который обеспечивает