Бёккер_Хроматография [2009]

250 Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография

4.11. Выводы

Под ВЭЖХ понимают сегодня высокоэффективную жидкостную хроматографию, а не хроматографию высокого давления. Хотя понятие «колонка» в названии от& сутствует, имеется в виду только колоночная хроматография, а не тонкослойная, которая сегодня также является высокоэффективной хроматографией.

С момента создания в начале семидесятых годов ВЭЖХ была и остается пред& метом в высшей степени интенсивных научных исследований с известным ме& жотраслевым характером. Научному и техническому прогрессу ВЭЖХ в равной мере способствовали аналитики, химики, физики и инженеры. ВЭЖХ стала се& годня одним из самых важных высокоэффективных методов разделения, что оче& видно из ежегодных продаж приборов, колонок, растворителей и вспомогатель& ных программ, а также из числа научных публикаций по анализам, проведенным с помощью ВЭЖХ. Этот метод применяется сегодня почти во всех областях про& изводства, контроля качества продуктов и экологии. Основное направление даль& нейшего развития – это фармацевтическое производство и анализ лекарствен& ных средств, экологический анализ, клиническая химия, биохимия и биотехно& логия, а также анализ пищевых продуктов.

Для известных методов разделения, таких как ВЭЖХ, не стоит ожидать сен& сационных инноваций, в то же время в самых различных областях применения постоянно происходят улучшения, причем основное внимание уделяется автома& тизации метода и непосредственному соединению пробоподготовки и метода оп& ределения. Высокие требования предъявляются к рутинным автоматическим уст& ройствам для контроля в области экологического анализа, что связано с высокой сложностью процесса жидкостной хроматографии и его зависимостью от приме& сей в пробе и элюентах, часто присутствующих в низких концентрациях. В после& днее время впервые были внедрены непрерывно работающие, надежные измери& тельные станции для автоматического контроля речной воды. Остатки пестици& дов в реках могут, таким образом, контролироваться непрерывно.

4.11.1. Сравнение ГХ(ВЭЖХ

Для того чтобы разделить вещества друг от друга, их необходимо перемещать по колонке. Подвижная фаза может быть газообразной, жидкой или сверхкритичес& кой, тогда как стационарная фаза может быть либо жидкая, либо твердая. Агре& гатное состояние подвижной фазы определяет области применения метода. ГХ и ВЭЖХ с их преимуществами и недостатками сосуществуют рядом друг с другом. Как говорил Парацельс,

Рядом, но не друг против друга.

Целью является правильный результат.

Так как газы смешиваются друг с другом в любых соотношениях, то газовая хроматография – более универсальный метод, чем ВЭЖХ. Летучесть веществ, в первом приближении, создает меньше проблем при вводе пробы в ГХ, чем ра& створимость веществ при вводе пробы в ВЭЖХ. Вместе с тем, это преимущество

4.11. Выводы 251

ГХ является и ее недостатком, так как все анализируемые вещества должны пере& водиться в парообразное состояние.

Так как жидкости не всегда смешиваются друг с другом в любых соотношени& ях, а твердые вещества растворимы не во всех растворителях, то метод ВЭЖХ силь& но ограничен уже при вводе пробы. Основное преимущество ВЭЖХ состоит в том, что исследуемые вещества не должны переводиться в пар, так как наибольшие ошибки в ГХ появляются как раз во время испарения.

В основном можно сказать следующее:

•ВЭЖХ подходит для всех растворимых веществ;

•ГХ подходит в тех случаях, когда можно испарить или провести пиролиз самих веществ или их производных.

Исключениями являются только

•термолабильные вещества,

•вещества, которые реагируют во время испарения друг с другом,

•вещества, которые образуют ионы.

Вто время как в ГХ необходимые для разделения взаимодействия происходят исключительно между молекулами аналита и стационарной фазой, а подвижная фаза служит только для транспорта, в ВЭЖХ взаимодействия происходят также между молеклами аналита, стационарной фазой и элюентом. Элюент взаимодей& ствует также со стационарной фазой. Таким образом, в обращеннофазовом мето& де полярная подвижная фаза полностью экранирует стационарную фазу от по& лярных взаимодействий с молекулами аналита.

Изменением подвижной фазы от полярной к неполярной молекулы аналита, связанные на стационарной фазе за счет дисперсных взаимодействий, снова осво& бождаются – элюируются. Этот метод нельзя использовать в ГХ. В то время как для анализа в ГХ ионные соединения должны быть модифицированы, в ВЭЖХ удается непосредственный анализ с помощью ионпарной хроматографии на обращенных фазах. Классический пример ВЭЖХ анализа ионов – это ионная хроматография на колонках с ионообменными сорбентами как современный уровень развития тех& ники в области анализа анионов и катионов. Для ГХ здесь нет места.

ВВЭЖХ сегодня работают преимущественно с обращеннофазовым методом.

ВГХ, которая подразумевает почти исключительно работу с капиллярными ко& лонками, используют в большинстве случаев так называемые химически приви& тые сорбенты. При этом для десорбции адсорбированных молекул аналита в рас& поряжении имеется лишь варьирование температуры и давления. Таким образом, если в ГХ для элюирования должны изменяться чисто физические параметры, то в ВЭЖХ используются целенаправленные химические воздействия. Программи& рование температуры не дает в ВЭЖХ нужных для разделения эффектов. В то время как в ГХ десорбция происходит просто и быстро с повышением температуры, в ВЭЖХ повышение температуры может приводить к необратимой адсорбции и, тем самым, к разрушению поверхности сорбента.

Основную проблему как в ГХ, так и в ВЭЖХ представляют поверхностные силанольные группы. В то время как в ГХ в газовом анализе еще применяют си&

252 Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография

ликагель, оксид алюминия или молекулярные сита со свободными ОН группами, чистый силикагель и оксид алюминия почти полностью исчезли из ВЭЖХ.

Сегодня колонки и для ГХ, и для ВЭЖХ используют подложки с низким со& держанием ОН групп. Фазы на основе силикагеля и колонки из плавленого квар& ца производятся по возможности свободными от катионов и освобождаются от остаточных ОН групп путем силанизации. В то время как в ГХ остаточные сила& нольные группы приводят лишь к усиленному «хвостованию», в ВЭЖХ они могут полностью блокировать необходимые взаимодействия. В этом случае остатки си& ланольных групп удаляются методом так называемого эндкеппинга (Endcapping). Из&за необходимой стабильности к гидролизу для ВЭЖХ нужны фазы с Si–N или Si–C связями. Si–O–C связи не подходят здесь из&за их чувствительности к гид& ролизу.

В противоположность ВЭЖХ в ГХ дезактивацию проиводят в газовой фазе при высокой температуре. Для этого используют почти исключительно октаме& тилтетрациклосилоксан и гесаметилерициклосилоксан, а также их производные. Последующее силанирование больше не требуется, так как в ходе этих реакций в капиллярных колонках происходит не только силанирование поверхности, но и образование полимерых слоев за счет раскрытия цикла и последующей полиме& ризации.

Величина поверхности используемых в ВЭЖХ сорбентов лежит между 100 и 500 м2/г. Обычные материалы для ГХ характеризуются поверхностями от 0,5 до 3 м2/г. Непосредственно с ГХ сегодня можно сравнивать только ВЭЖХ на капиллярных колонках, так как за исключением отдельных случаев, преимущественно при разде& лении газов, в ГХ никакие наполненные колонки больше не применяются.

4.11.1.1. Хроматографические колонки

Сегодня для ВЭЖХ преимущественно используются колонки с обращенной фа& зой (ОФ) С18 длиной от 12,5 до 25 см. В ГХ используются, почти исключительно, капиллярные колонки с полидиметилсилоксановой стационарной фазой длиной 30 или 60 м. Переменной является только толщина слоя стационарной фазы, ко& торую изменяют, чтобы обеспечить, особенно в случае МС и ИК&Фурье детекто& ров, более высокую нагрузочную емкость колонки.

Так как в ГХ, из&за использования исключительно капиллярных колонок из плавленого кварца, в распоряжении имеются стационарные фазы, лишь немного отличающиеся по полярности, то не может быть и речи о том, чтобы идентифи& цировать компоненты сравнением целенаправленно предварительно рассчитан& ных и реальных разделений, и информацию, которую не удается получить вслед& ствие близости времен удерживания, пытаются компенсировать применением идентифицирующих систем детектирования. Это является причиной того, поче& му применение находят почти исключительно капиллярные колонки с полиди& метилсилоксановой стационарной фазой. Так как эта стационарная фаза может быть привита к внутренней стенке капилляра и проявляет к тому же наибольшую термостабильность, то она имеет наименьший фон, возникающий вследствие вы& носа фазы из колонки и прекрасно подходит для использования с масс&спектро& метрическими детекторами. Источник ионов при этом больше не загрязняется

4.11. Выводы 253

выносимыми продуктами, и колонки не нужно менять, так как они работают вплоть до предельных температур.

Таким образом в ГХ с самого начала применяется МС и/или ИК&Фурье&сис& тема, так как известно, что идентификация аналитов по данным удерживания на этих аполярных колонках вряд ли возможна, а подтверждение с помощью второй полярной колонки слишком сложно или даже невозможно для пользователя. Соб& ственные возможности хроматографии по идентификации соединений часто иг& норируют в ГХ, чтобы не менять колонки или чтобы «произвести впечатление» с помощью дорогих и сложных детекторов.

В ВЭЖХ это наблюдается не так часто. Правда, также и здесь нет такого, что& бы идентифицировать соединения по предварительно рассчитанным данным, но все же существующие между подвижной и стационарной фазами взаимодействия используются достаточно целенаправленно. Напротив при ГХ во многих случаях вообще не стараются достичь полного разделения, а вместо этого пытаются про& вести на компьютере виртуальное «разделение», используя данные МС& или ИК& Фурье детектора.

Если сравнивать ВЭЖХ с ТСХ и ГХ, то можно отметить, что в ВЭЖХ, в срав& нении с ГХ, не так много исследователей проводят их «разделения» виртуально, но если все же такое «разделение» проводится, то тогда в степени большей, чем это реально необходимо. Напротив, в ТСХ работают только экспериментально.

ВЭЖХ обеспечивает во многих случаях более надежный и более быстрый ана& лиз, чем ГХ. Расходы на выполнение ВЭЖХ анализов сильно упали, тогда как затраты на ГХ анализы постоянно возрастают, так как почти каждый пользова& тель хочет использовать масс&селективный детектор, а не ПИД, который лучше подходит для количественного анализа.

Стомость колонок также свидетельствует в пользу ВЭЖХ, нежели ГХ. При использовании в ВЭЖХ микроколонок пользователь имеет дополнительную воз& можность сэкономить на растворителях. Здесь имеется даже двойная экономия – во время анализа и при утилизации растворителей. Если включить теперь в срав& нение и ТСХ, то с этим методом можно достичь такой стоимости анализа и быст& роты его выполнения, что остается неясным, почему сегодня ТСХ используется так мало.

Потребление растворителей колонкой с внутренним диаметром 4,6 мм при по& токе 2 мл/мин составляет 220 л в год. Для колонки с внутренним диаметром 2,1 мм и потоком только 0,4 мл/мин в год потребление составляет лишь 44 л. При этом следует сравнивать не только закупочные цены, но и цены утилизации отходов. Особенно интересна здесь снова ТСХ, которая одновременно позволяет прово& дить без проблем несколько параллельных анализов (как правило, более десяти), используя лишь 3 мл растворителя.

«Капиллярные колонки» пока потому не так распространены сегодня, что боль& шинство насосов в этой области потоков не дают надежно воспроизводимых гра& диентов. Другая помеха для широкого использования колонок диаметром 2,1 мм – это их незначительный рыночный ассортимент. Изократический анализ в ВЭЖХ можно сравнить с изотермическим анализом в ГХ. Если делятся сложные много& компонентные смеси, то в ВЭЖХ можно использовать градиентное элюирование

254 Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография

(непрерывное изменение полярности подвижной фазы). В ГХ в распоряжении имеется метод программирования температуры.

4.11.1.2. Детекторы

Для ВЭЖХ имеется большее количество детекторов, чем для ГХ. Решающим не& достатком ВЭЖХ однозначно является отсутствие ПИД. Преимущества детекто& ра с диодной линейкой, а также детекторов по флуоресценции снижаются их не& универсальностью и, кроме того, их чувствительность оказывается, в большин& стве случаев, в среднем на 3–4 порядка хуже, чем у ПИД. Рефрактометры настолько нечувствительны, что их едва ли можно применять.

Сегодня непосредственное сравнение с ГХ возможно благодаря комбиниро& ванию обоих методов с масс&спектрометрами. Решающим преимуществом ВЭЖХ/ МС гибрида является возможность применения в области термолабильных, реак& ционных и, прежде всего, высокомолекулярных соединений. Важную роль в ВЭЖХ/МС играют интерфейсы.

4.11.1.3. Приборы

Устройства ВЭЖХ и ГХ коммерчески доступны для всех приложений. Самоделки и перестроенные приборы, которые были типичны в прошлом, сегодня больше не нужны. Для ВЭЖХ имеются в наличии разнообразные комбинации систем вво& да пробы, колонок, колоночных термостатов, детекторов и компьютеров. Таким образом, можно сконструировать оптимальный прибор.

В ГХ такая возможность полностью исключена, так как здесь все устройства управляются исключительно микропроцессорами. Поэтому комбинировать де& текторы, термостаты и т.д., произведенные разными производителями, могут лишь немногие специалисты. В рутинной ГХ, между тем, это стало невозможным. Даже подключение рабочего компьютера к ГХ может быть проблематиченым. Это об& стоятельство является серьезным недостатком ГХ.

Стандартное оборудование для ВЭЖХ состоит из петлевого крана для ручно& го ввода пробы, градиентного насоса, детектора УФ/видимой области и компью& тера. Как правило, дополнительно могут подключаться детектор с диодной ли& нейкой, флуориметр и МСД. Заметного прогресса, в сравнении с ГХ, достигло проведение ВЭЖХ в автоматическом режиме. Постепенно появляются приборы для промышленной ВЭЖХ.

4.11.2. ВЭЖХ в экологическом анализе и анализе пищевых продуктов

ВЭЖХ анализ отдельных ингредиентов или групп веществ требует высоких зат& рат на пробоподготовку, принимая во внимание, что в большинстве случаев про& ба находится в сложной матрице. Издержки можно сократить, если в распоряже& нии имеются соответствующие селективные системы для разделения и детекти& рования. Значительную помощь при этом оказывает автоматическое управление системой от ввода пробы и градиентного элюирования до одновременного детек& тирования на нескольких длинах волн или одновременного использования не& скольких разных детекторов [4.49].

4.11. Выводы 255

На переднем плане анализа окружающей среды стоит анализ питьевой воды. Так как питьевую воду получают главным образом из поверхностных вод, то дол& жны анализироваться и контролироваться как содержание ионных неорганичес& ких веществ, так и наличие следовых органических загрязнений. Важно, что та& кие анализы могут проводиться не только в соответствующих коммунальных и государственных лабораториях, но и то, что могут быть установлены надежные и автоматизированные измерительные станции, которые на месте обнаруживают и определяют содержание определенных загрязнений. Пример подобного рода – это контроль качества воды Рейна.

Для определения пестицидов в питьевой воде применяются как газохрома& тографические методы, так и методы жидкостной хроматографии. В то время как в ГХ достаточную чувствительность показывают только такие специальные де& текторы, как ДЭЗ или АФД, то ВЭЖХ с УФ детектром может применяться более универсально. При использовании многоволнового детектора можно в одном хро& матографическом разделении отслеживать более 30 подлежащих контролю ве& ществ [4.50].

4.11.3. ВЭЖХ в лекарственном анализе

Основное применение ВЭЖХ находит при разработке, получении и контроле ка& чества лекарств. Здесь можно выделить четыре области: ВЭЖХ как метод анализа при развитии синтетических или гомеопатических препаратов и как метод ана& лиза в контексте клинических, токсикологических и фармакологических иссле& дований. Основной задачей здесь является определение активных веществ и про& дуктов их превращений (метаболитов) в сложных матрицах (плазма, сыворотка, моча, секрет и т.д.), в которых они, конечно, присутствуют в незначительных кон& центрациях. Концентрации находятся, как правило, в области от микрограмм до нанограмм на миллилитр жидкости.

Особый интерес в области анализа активных веществ представляют хиральные соединения. Это вещества, которые существуют в двух оптически активных фор& мах, которые с точки зрения их структры соотносятся как картина и ее зеркальное отражение. Химически и физически они идентичны, и их можно различить только по специфическим взаимодействиям с другими хиральными соединениями. В ра& цемате обе оптически активные формы (энантиомеры) существуют в равном коли& честве (1 : 1). Тем не менее, энантиомеры могут отличаться друг от друга фармако& логической активностью. Это должно быть установлено в ходе клинических и фар& макологических исследований. Для этого нужны оптически чистые энантиомеры, которые можно получить либо стереоспецифическим синтезом, либо разделением рацемата. В течение последних лет для разделения рацематов были разработаны эффективные методы ВЭЖХ, которые используют специальные колонки с хираль& ными селекторами. Этими методами можно не только быстро аналитически разде& лить смесь энантиомеров, но проводить препаративные разделения с выделением соответствующих энантиомеров в килограммовых количествах.

Особое значение приобретает сегодня область анализа следов оптически ак& тивных соединений. В настоящее время клинические и фармакологические ис&

256 Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография

следования энантиомеров активных веществ предписаны законодательно. Из бо& лее чем 800 известных сегодня в Германии лекарственных веществ около полови& ны являются хиральными веществами. Это показывает значение разделения энан& тиомеров с помощью ВЭЖХ. Определение чистоты является необходимым, так как содержание нежелательного энантиомера в основном продукте должно быть менее 0,1%. Поскольку пестициды нового поколения также часто хиральны, то здесь открывается большое поле деятельности для ВЭЖХ. Ввиду того, что методы энантиоселективнлого синтеза не так легко реализовать в промышленности, раз& деление энантиомеров хроматографическими методами может стать еще одной областью применения препаративной ВЭЖХ.

Актуальная область применения ВЭЖХ – это разработка современных лекар& ственных средств. Антисенснуклеотид рассматривается как лекарство будущего. При этом речь идет о полинуклеотидах, которые состоят, соответственно, из 20–30 осно& ваний и могут тормозить синтез белка. Предпосылкой к синтезу такого антисенс& нуклеотида является знание структуры и анализ генома или, по меньшей мере, той его части, которая управляет соответствующими нуклеотидными последова& тельностями, ответственными за синтез белка.

ВЭЖХ и капиллярный электрофорез, в сочетании с масс&спектрометрически& ми методами, представляют для этого эффективный инструментарий, чтобы выде& лить синтетический антисенснуклеотид и охарактеризовать его свойства. С помо& щью полученных данных можно оптимизировать химические структурные элементы при синтезе этих материалов. Результаты служат также для того, чтобы понять ме& ханизм развития вирусных инфекций и других болезней и разработать соответству& ющие лекарственные препараты.

Сегодня все больше лекарств производится с помощью генной технологии. К чистоте таких продуктов, как, например, рекомбинантные белки, предъявляют& ся высокие требования, прежде чем они будут выпущены на рынок. Еще несколько лет назад анализ этих препаратов стоил в высшей степени дорого, в ряде случаев даже чересчур дорого. С помощью ВЭЖХ/МС с ионизацией электрораспылением, например, белки могут быстро и надежно характеризоваться до молекулярных ве& сов 100 000. При этом могут быть обнаружены даже небольшие «ошибки» в строе& нии белка.

4.11.4. ВЭЖХ в биомедицинском анализе

Быстро развивающаяся область применения ВЭЖХ – это биомедицинский ана& лиз и терапия. Химически и/или ферментативно специально подготовленные пористые носители позволяют интегрировать в систему ВЭЖХ проводимую все еще преимущественно вручную, а поэтому содержащую ошибки и дорогостоя& щую подготовку биологических жидкостей. Таким образом, удается полностью автоматизировать обычное определение диагностически релевантных, фармако& логически эффективных, а также токсикологически значимых веществ в рамках терапевтического лекарственного контроля и биологического мониторинга. Сор& бенты, используемые в качестве материалов для заполнения предколонок, позво& ляют реализовать одновременно несколько механизмов разделения (эксклюзи&

4.11. Выводы 257

онная хроматография и селективная адсорбционная или аффинная хроматогра& фия) и дают возможность осуществлять многократный ввод пробы и селектив& ную динамичную экстракцию протеинсодержащих проб.

Применение хроматографических носителей для экстакорпоральной обработ& ки плазмы или цельной крови человека является очень привлекательным в тера& певтическом плане методом, на который обратили внимание лишь в последнее время. Селективное устранение патогенных компонентов крови предъявляет вы& сочайшие требования (например, возможность стерилизации, химическую ста& бильность, био& или гемсовместимость) к применяемым сорбентам.

Представленные тенденции указывают направления, в которых совершен& ствуется исследование в этой области. Следующий также важный вопрос – это техническое улучшение компонентов системы ВЭЖХ и новые концепции интег& рированных устройств.

4.11.5. Подготовка проб

Пробоподготовка, в частности, из матриц сложного состава, представляет все еще до конца не решенную проблему. Пробоподготовка требует больших временных и денежных затрат и должна поэтому автоматизироваться и интегрироваться в хро& матографическую систему. Наряду с традиционной твердофазной экстракцией были предложены новые методы на основе мембран, электроосмоса и т.д., кото& рые, однако, находятся еще в стадии развития. Другая концепция основывается на том, чтобы использовать очень селективные предколонки.

При биоанализе и фармацевтическом анализе к пробоподготовке предъявля& ются высокие требования, так как активные вещества, существующие в незначи& тельных концентрациях, необходимо выделять и концентрировать из очень слож& ных матриц, таких как плазма или моча, содержащих большое количество приме& сей. Пробоподготовка, которую часто все еще проводят вручную, ведет к ошибкам, и в будуующем она должна быть интегрировани в хроматографическую систему, а в рутинном анализе ее проведение должно быть полностью автоматизировано. Для этого вида пробоподготовки все чаще используются специальные селективные сор& бенты, проявляющие двойственные хроматографические свойства.

Такие комбинированные фазы имеют высокогидрофобную внутреннюю по& верхность относительно узких пор, где адсорбируются низкомолекулярные ак& тивные вещества, и гидрофильную внешнюю поверхность, которая не сорбирует белки. Такие предколонки позволяют многократный ввод пробы и селективную динамичную экстракцию низкомолекулярных активных веществ из проб, содер& жащих большое количествао белка.

Для концентрирования компонентов проб определенных классов веществ ча& сто используются очень специфические фазы с высокой избирательностью. На& ряду с твердофазной экстракцией, все чаще применяемой в режиме онлайн, бу& дут использоваться также новые технологии с мембранами, электроосмосом и др. Наука, конечно, еще довольно долгое время будет заниматься вопросами пробо& подготовки, ее стандартизации и выработки общего оптимального алгоритма дей& ствий при концентрировании и выделении веществ.

258 Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография

4.11.6. ВЭЖХ колонки

На практике тенденции развития колонок определяются пользователями. Опыт показал, что попытки со стороны производителей убедить пользователей приме& нять определенную новую технологию, даже если она была лучше старой, натал& кивались большей частью на сопротивление. Поэтому многие производители очень сдержанно вкладывают средства в развитие новых колонок для ВЭЖХ. Они делают это только в том случае, если появляются определенная потребность и ры& нок сбыта. Все же постоянный интерес пользователей к новым колонкам вызвало

впоследнее время значительную перемену в технологии получения колонок. Боль& шое внимание уделяется повышенной производительности колонок, улучшен& ной стабильности сорбента и их воспроизводимости. Большие успехи достигну& ты в плане получения сорбентов на несиликагельной основе.

Многочисленные новшества в технологии получения колонок привели в пос& ледние годы к важным успехам в этой области. Колонки малого диаметра, капил& лярные колонки и короткие колонки можно оптимально применять для опреде& ленных задач, что дает преимущества по сравнению со стандартными колонками. Разумеется, насосы и мертвые объемы для этих устройств должны быть соответ& ственно миниатюризированы, а время отклика детектора сокращено и т.д.

Выделяются две тенденции развития разделительных колонок ВЭЖХ. Наряду со стандартными колонками, например, в ОФ хроматографии, в обращение вхо& дят во все возрастающей мере колонки, созданные для специальных задач, на& пример, для определения полициклических ароматических веществ, катехолами& нов, сахаров, разделения энантиомеров и т.д. Ввиду широкого применения коло& нок, например, в биоанализе активных веществ, к ним в процессе валидации ме& тода или законодательных регламентов предъявляют все более высокие требования

вплане воспроизводимости и стандартизации. Вместе с тем это означает, что вне& дрение новых стационарных фаз и колонок на рынок является медленным про& цессом, если только они не обладают какими&то исключительными свойствами и производителоьностью.

4.11.6.1.Другие фазы

Вобращеннофазовой ВЭЖХ, которая применяется для примерно двух третей всех разделений, проводимых ВЭЖХ, доминирует сорбент C18. Наблюдается тенден& ция к использованию ОФ с более короткими жирными цепями C8, с одной сто& роны, поскольку они позволяют использовать элюенты с низким содержанием органической фазы, с другой стороны, на этой фазе многие классы веществ элю& ируются в середине шкалы удерживания, и, наконец, эти колонки часто имеют более высокую эффективность. Эта тенденция отражается в появлении запатен& тованных стерически защищенных C8, фенил& и цианофаз, которые проявляют высокую стабильность по отношению к агрессивным подвижным фазам. ОФ с еще более короткими алкильными группами все больше находит применение в ВЭЖХ для разделения белков и других биомолекул.

Другая тенденция – это использование стационарных фаз с функциональны& ми группами, которые обеспечивают абсолютно другую селективность, чем ши&

4.11. Выводы 259

рокоприменяемые алкильные лиганды. Выбор другой фазы особенно важен в тех разделениях, когда на селективность разделения не удается повлиять, измененяя состав подвижной фазы.

Фенил& и цианопроизводные сорбентов – это самые перспективные канди& даты благодаря значительным различиям во взаимодействии со многими веще& ствами. Большой интерес представляет разделение рацематов. Поэтому можно быть уверенным, что будут разработаны новые колонки с активными хиральны& ми стационарными фазами. Новые хиральные колонки существенно стабильнее, с одной стороны, и значительно дешевле, с другой стороны, в рутинных условиях.

Можно предсказать, что возобновится интерес к нормальнофазовой хрома& тографии ввиду ее широкой области селективностей и превосходных свойств для препаративной хроматографии. Но прежде, чем это произойдет, должны быть со& зданы новые улучшенные адсорбенты. В настоящее время все немодифицирован& ные адсорбенты дают неудовлетворительные и невоспроизводимые результаты. Большинство привитых нормальных фаз также показывают более низкую эффек& тивность разделения и плохую форму пиков, чем соответствующие обращенные фазы.

4.11.6.2. Новые материалы

Без сомнения, силикагель останется предпочтительным материалом для многих типов сорбентов. Этот материал, обладающий прочной структурой, всегда может быть получен с большим разнообразием размеров частиц и пор, а также внутрен& ней поверхности. Более того, новые сорбенты из очень чистого силикагеля могут обладать улучшенными поверхностными характеристиками, позволяющими эф& фективно разделять смеси таких биомакромолекул, как белки и пептиды.

Новые сорбенты на основе графитизированного углерода, оксидов алюминия, титана и циркония применяются в тех приложениях, для которых не подходят сорбенты на основе силикагеля. В ближайшем будущем нет оснований ожидать резких изменений в технологии приготовления колонок для ВЭЖХ. Будут наблю& даться лишь постепенные улучшения и изменения. Особый интерес в будущем будет проявлен к колонкам, заполненым улучшенными полимерными сорбента& ми. Вероятно, они позволят повысить еще дальше эффективность и воспроизво& димость разделений, чем это было возможно до сих пор.

4.11.6.3. Миниатюризация

Медленно, но непрерывно развитие идет в направлении колонок с меньшим внут& ренним диаметром, так называемых микроколонок с внутренним диаметром от 1 до 2 мм. Это развитие инициируется преимущественно пользователями из области естественных наук, у которых для анализа в распоряжении имеются только огра& ниченные количества пробы. Напротив, другие пользователи заинтересованы в колонках малого внутреннего диаметра из&за необходимости сокращать расход растворителей. В будущем на первый план выйдут проблемы снижения издержек и утилизации отходов.

Колонки малого диаметра потому распространены еще не очень широко, что большинство насосов в этой области потоков не могут обеспечить надежное и