Бёккер_Хроматография [2009]

210 Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография

наибольшую избирательность по отношению к нежелательным компонентам ана& лизируемой смеси и необходимую чувствительность к целевым компонентам, выбирается исходя из свойств веществ, которые должны быть известны как мож& но более полно. Специфическая модификация функциональных групп анализи& руемых веществ до или после хроматографической колонки совершенно одно& значно влияет на чувствительность и избирательность детектирования по погло& щению ультрафиолетового света, флуоресценции или при электрохимическом детектировании.

4.7. ВЭЖХ детекторы

Большое число пользователей и широкий спектр приложений ВЭЖХ вызвали, естественно, появление большого числа фирм, производящих соответствующее оборудование. Возник большой, необозримый рынок, на котором новые фирмы успешно конкурируют с уже известными производителями [4.13]. Рынок быстро развивается с прогнозируемым на следующие годы приростом в области 15%. При этом дальнейшее развитие детекторов происходит в двух направлениях: с одной стороны, это совершенствование существующих моделей детекторов в плане по& вышения их чувствительности, стабильности и одновременного уменьшения объе& ма кювет и, с другой стороны, это внедрение «умных» концепций, таких как, на& пример, программирование параметров детекторования в процессе регистрации хроматограммы, выполняемых как на самом детекторе, так и с внешнего програм& мирующего устройства центральной системы управления и сбора данных.

Примерная оценка доли применяемых в настоящее время различных типов детекторов, по данным исследований конъюнктуры рынка, приведена в табл. 4.4.

Под строкой «другие» в табл. 4.4 подразумеваются такие важные детекторы, как кодуктометрический детектор, а также такие системы, как комбинации ВЭЖХ& МС или ВЭЖХ&ИК, распространение которых на данный момент еще сравни& тельно невелико несмотря на их преимущества при качественном анализе, т.е. качественной интерпретации хроматографических пиков.

Таблица 4.4. Оценка доли использования самых важных типов детекторов

4.7.1. Общие требования к ВЭЖХ детекторам

Требования к ВЭЖХ детекторам определяются, с одной стороны, самой хрома& тографической системой, и прежде всего колонкой и ее свойствами, а, с другой стороны, вечным стремлением к быстрому и часто селективному обнаружению все более низких концентраций веществ. В области рутинного анализа самыми

4.7. ВЭЖХ детекторы 211

важными требованими к детектору являются высокая чувствительность и стабиль& ность базовой линии.

С уменьшением диаметра аналитических колонок от 4,6 мм к 4–3 мм далее к 2 и 1 мм (а в капиллярной ВЭЖХ и еще меньше) возникла необходимость умень& шения объемов детектирования от традиционных 10 мкл до менее чем 1 мкл. Про& изводители детекторов пытаются следовать этой тенденции, однако ее реализа& ция для детекторов различных типов протекает с различным успехом.

Второе требование – возможно более короткое время анализа при одновре& менно высокой чувствительности обнаружения – подразумевает, с одной сторо& ны, все более короткое время отклика детектора как следствие прохождения че& рез кювету узких пиков – сегодня это примерно 20 мс – и, с другой стороны, воз& можно более низкий шум детектора. Эти требования – короткое временя отклика и низкий шум – являются взаимоисключающими. Так как взаимная оптимиза& ция этих параметров может происходить только в рамках решения конкретной проблемы, то детекторы нового поколения оснащаются сегодня в большинстве случаев ступенчатыми регуляторами времени отклика или, соответственно, по& стоянной времени (например, между 20 мс и 10 с).

На практике следует обращать внимание на то, что время отклика 20 мс ника& кой обычный самописец зарегистрировать не может. Такие короткие времена от& клика нужны только при очень быстрых ВЭЖХ анализах с шириной пика до 1 с и, естественно, тогда переходят на электронный сбор данных или специальные бы& стрые самописцы.

В противоположность этому в гельхроматографии, а также в более сложных хроматографических задачах есть еще сегодня анализы, которые продолжаются час или более. Граница обнаружения для них определяется не только кратковре& менным шумом, но и долговременными колебаниями и отклонением базовой линии детектора. Дрейф нулевой линии является проблемой, прежде всего, для детекторов, измеряющих общие свойства веществ, например, показателя пре& ломления, когда, как сигнал детектора, воспринимаются сравнительно неболь& шие изменения этого общего свойства. В этих случаях колебания температуры, давления, а также величины потока сказываются на дрейфе базовой линии не& сравнимо более сильно, чем, например, в ультрафиолетовом детекторе. УФ де& тектор при данной длине волны специфически «видит» только поглощение про& бы, но не элюента, так что его с хорошим приближением можно считать не& чувствительным к эффектам, оказываемым температурой или давлением на элю& енты.

Все чаще требованием, предъявляемым к детекторам, становится определен& ный интеллект или же их интегрируемость в систему ВЭЖХ. Тем самым хотят до& стичь как полной автоматизации хроматографического анализа от ввода пробы до выдачи результатов, так и, прежде всего, настройки параметров детектора на оптимальное детектирование каждого из хроматографических пиков. Этого мож& но достичь с помощью внутреннего или внешнего программирования во времени таких параметров детектора, как чувствительность, постоянная времени, автома& тическая коррекция базовой линии (между отдельными пиками) или, например, изменением рабочих длин волн у спектрометров.

212 Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография

Включение в ВЭЖХ систему компьютеров и соответствующих запоминаю& щих средств позволяет, например, у спектрометров с диодной линейкой, масс& спектрометров и ИК&Фурье приборов получать спектры либо одновременно, либо последовательно, но в любом случае достаточно быстро (до нескольких спектров в секунду), что сильно повышает качественную информацию об анализируемой пробе. При наличии библиотек спектров тогда становятся возможными иденти& фикация и определение чистоты пика и идентичности вещества.

4.7.2. Детекторы УФ( и видимого диапазона

Детекторы УФ& и видимого диапазона во всех их вариантах являются сегодня наи& более распространенным видом детекторов ВЭЖХ. Принцип действия основы& вается на ослаблении луча монохроматического света при прохождении через проточную кювету, заполненную веществом пробы. Величина ослабления зави& сит от коэффициента поглощения вещества ε, концентрации компонента пробы в подвижной фазе c и толщины слоя d. Это ослабление света описывается безраз& мерной величиной поглощения E, которая выражается через вышеназванные фак& торы по закону Бугера–Ламберта–Бера:

E = ε c d.

Чтобы получать возможно более высокую чувствительность, оптический путь d через кювету нужно сделать настолько большим, насколько это возможно. С дру& гой стороны, объем кюветы должен быть мал соответственно количеству проходя& щего потока. При этом типичные размеры кюветы – это толщина слоя 10 мм при объеме примерно 8 мкл.

Детекторы УФ& и видимого диапазона относительно невосприимчивы к из& менениям общих свойств элюатов при колебаниях температуры и потока или, например, состава элюата при градиентном элюировании (пока сам элюент не поглощает свет). Эта индифферентность одновременно ограничивает примени& мость фотометрии: она позволяет обнаружить в элюате только такие компонен& ты, которые поглощают свет при больших длинах волн, чем сам элюент. Это зна& чит, что даже в метаноле, воде или ацетонитриле (или смеси этих элюентов) мож& но обнаружить только те соединения, которые поглощают свет при длинах волн больше 190 нм, поэтому нижняя граница рабочей области всех доступных сегод& ня фотометрических детекторов ограничена 190 нм.

Поглощение при длинах волн, больших чем 190 нм, наблюдается у соедине& ний тогда, когда в их молекуле есть как минимум одна из следующих групп:

•двойная связь рядом с атомом, несущим неподеленную пару электронов (например, виниловый эфир C=C–O–C),

•гетероатомы: бром, йод или сера,

•карбонильная группа –C=O,

•сопряженные двойные связи –C=C–C=C–

•или ароматическое кольцо.

Эти группы неодинаково поглощают свет и, кроме того, при разных длинах волн. На интенсивность поглощения и положение максимума поглощения влияют так&

214 Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография

детектор можно настроить на длину волны максимума поглощения определяемо& го вещества.

Вольфрамовые лампы выпускают для ближней ультрафиолетовой и видимой областей (примерно от 340 до 850 нм). Они – идеальное дополнение к дейтерие& вым лампам. Как у дейтериевой лампы, так как и у вольфрамовой лампы ширина спектральной полосы не должна быть настолько узкой, как это имеет место в реги& стрирующих спектрометрах. Обычно ширина полосы составляет примерно 10 нм, т.е. отфильтрованный свет не монохроматический, а охватывает область, напри& мер, от 280 до 290 нм при выбранной длине волн 285 нм. Это имеет то преимуще& ство, что луч имеет большую интенсивность и тем самым увеличивается чувстви& тельность детектора. Однако ширина диапазона не может быть слишком боль& шой, так как иначе сужается линейная область детектора.

Чтобы в полной мере использовать чувствительность сегодняшних детекто& ров УФ& и видимого диапазона в области коротких длин волн (от 190 до 250 нм), рекомендуется брать хорошо очищенные элюенты. К тому же реагенты специаль& ного качества для ВЭЖХ сегодня доступны коммерчески. Рекомендуется дегази& ровать элюенты с помощью гелия или, по крайней мере, азота, чтобы умень& шить собственное поглощение элюентов, обусловленное присутствием кисло& рода.

Едва ли можно полностью избежать дрейфа базовой линии при градиенте ра& створителя, даже если сами компоненты элюента свет не поглощают. Это связано с изменением коэффициента преломления, которое при потерях отражения на границе фаз окно кюветы/элюент вызывает мнимое поглощение и, вместе с тем, изменение базовой линии. Конструктивно этот эффект можно минимизировать, и оптика более новых приборов устроена соответствующим образом. Дополни& тельные возможности представляет микропроцессорная техника, которая позво& ляет записывать базовую линию для пустого градиента и вычитать ее из последу& ющих хроматограмм.

Сегодня чувствительность самых последних моделей детекторов УФ& и види& мого диапазона и детекторов с постоянной длиной волны настолько высока, что существенного дальнейшего повышения ожидать уже не стоит. Чувствительность новейших детекторов составляет (2–5) 10–5 оптических единиц поглощения, что довольно хорошо соответствует теоретически предельно достижимой величине (следует из статистики фотонов) для ширины полосы от 5 до 10 нм при 250 нм с кюветами диаметром 1 мм и длиной 10 мм с дейтериевой лампой. Так что для этих приборов нет теоретических предпосылок для существенного повышения чувстви& тельности. Тем не менее, это возможно при использовании импульсных ламп, дающих более мощный световой поток. Первые устройства такого типа недавно появились на рынке.

Стандартная область измерения простирается от примерно 0,001 до 2,0 опти& ческих единиц поглощения (ОЕП). При поглощениях более 1 ОЕП, в общем слу& чае, наблюдается отклонение от линейности, что будет мешать при препаратив& ных разделениях. Также следует учитывать, что, как правило, по мере службы при& бора доля рассеянного света монохроматоров в спектрофотометрах возрастает, что ухудшает линейность прибора в верхней области поглощения (и только там!).

4.7. ВЭЖХ детекторы 215

Стандартной является операция автоматического «обнуления» прибора, т.е. установка базовой линии на ноль и отметка «сигнал маркера» о начале измерения при нажатии соответствующей кнопки. Обе операции у большинства приборов можно выполнить также внешним замыканием контакта. Полезное для многих приложений свойство некоторых новых спектрофотометров – это возможность временного программирования таких важных параметров устройств, как длина волн, область измерений, автоматическое обнуление и т.п., или возможность внеш& него управления этими параметрами, что позволяет тогда полное системное ин& тегрирование таких приборов. При временной программной установке длин волн во время текущей хроматограммы для детектирования используются разные дли& ны волн. Это дает то преимущество, что для каждого вещества достигается опти& мальная чувствительность по поглощению света.

Если анализируются пробы с качественно точно известным составом, то дан& ный метод позволяет определять химическое соединение количественно по пло& щади пика и качественно по времени удерживания. Метод не работает, если ве& щества должны определяться в такой сложной матрице, как это имеет место в экологии, в аналитике пищевых продуктов и в клинической химии, а также если нужно перепроверить идентичность вещества. Простой расчет показывает нам, что существует 107 известных хроматографируемых соединений, из которых, тем не менее, по времени удержания на хроматограмме могут отличаться только 102. Следовательно, для вышеупомянутых областей приложения не только теорети& чески, но также практически высока вероятность того, что под одним пиком мо& гут скрываться несколько веществ.

Если вопреки ожиданиям пик на хроматограмме соответствует не химическо& му соединению, а содержит дополнительные нежелательные или неизвестные соединения, то говорят о загрязнении пика. Поэтому необходим метод, позволя& ющий быстро и без больших издержек обнаружить загрязнения пика. Возможные действия для этого:

•одновременное измерение при нескольких длинах волн и расчет соотве& ствующего отношения интенсивностей или

•измерение УФ& и видимых спектров веществ, которые проходят через про& точную кювету детектора.

Обычные спектрофотометры предлагают возможность ручного или автома& тического изменения длин волн посредством механической перестановки пози& ций конструктивных элементов. В зависимости от типа прибора меняется либо спектральная область, которая падает на твердо установленный светоприемник, либо изменяется его собственное положение.

Запись спектров поглощения методом «сканирования», т.е. механическое пе& ремещение по определенной области длин волн, продолжается от нескольких се& кунд до нескольких минут – в зависимости от типа сканирующей техники и ши& рины, выбранной области длин волн. Так как элюируемый пик за это время за& метно перемещается в измерительной ячейке или даже полностью покидает ее, то при записи спектров должны быть приняты специальные меры. Для этого поток элюента в ячейке детектора останавливается. Запись спектров методом «останов&

218 Глава 4. Высокоэффективная жидкостная (колоночная) хроматография

лишь другие фотодиоды, и никакие части механически больше не перемещаются. Для записи спектра последовательность сигналов диодов очень быстро считыва& ется и сохраняется в компьютере.

При этом скорость записи ограничивается по существу только лишь скорос& тью сбора и обработки данных. Если все фотодиоды по очереди постоянно опра& шиваются в очень быстром временном цикле, то в любое время получают полный спектр поглощения пика: длина волны выступает как третье измерение наряду со временем и поглощением. Если записывают сигнал только одного фотодиода, то наблюдают изменение поглощения в зависимости от времени для определенной длины волны – как для классической хроматограммы [4.16].

Детектор с диодной линейкой измеряет поглощения не только при одной или нескольких длинах волн, но и во всем спектральном диапазоне. Получаемая при этом информация открывает абсолютно новые возможности для количественной оценки и контроля:

•проверка чистоты пика по спектрам,

•идентификация пика по спектрам сравнения,

•выбор оптимальной длины волны для детектирования различных веществ.

Неразделенные пики можно идентифицировать и проверить непрерывным ска& нированием фотодиодной линейкой без дополнительных измерений. При норми& ровании пика проводится вычисление отношения величин поглощения пика при двух или нескольких длинах волн. У обычных УФ детекторов необходимо измере& ние, по крайней мере, при еще одной длине волны, чтобы получить отношение поглощений (Ratiogramme) для каждого компонента. Изменение величины отноше& ния указывает на совместное элюирование следующего компонента. У детектора с диодной линейкой это отношение вычисляется автоматически в режиме Ratio&Plots.

Другое преимущество многоканального детектора состоит в том, что вся спек& тральная область исследуется одновременно. Информация, получаемая при од& новременном детектировании на многих длинах волн, часто представляется в фор& ме трехмерного графика. При этом нужно учитывать, что УФ спектры не так ха& рактеристичны, как, например ИК или масс&спектры. Тем не менее, с привлече& нием численных методов полученные спектры, после незначительной коррекции, могут использоваться для распознавания веществ. Чем лучше спектральное и циф& ровое разрешение используемых спектров, тем надежнее могут применяться чис& ленные методы и тем легче использовать для идентификации обычно небольшие различия в форме и положении полос. Это гарантируется в первую очередь силь& ной светооптикой, которая дополняется электроникой, способной различать сиг& налы, близкие к уровню шумов [4.17]. Этим гарантируется то, что будут записаны действительно реальные спектры, а не «цифровые скачки» [4.18].

Спектроскопия знает различные способы сглаживания шумов. Самый про& стой способ – это увеличение времени регистрации или для спектрометров с ди& одной линейкой увеличение числа записанных спектров. Этот способ в случае хроматографии нельзя применять непосредственно, так как здесь работают во временном интервале, и при использовании этого метода можно было бы ожи& дать искажений вследствие изменения концентрации.

4.7. ВЭЖХ детекторы 219

При коротких временах удерживания полуширина пика составляет от 2 до 5 с. Чтобы полностью охватить эти быстрые пики, требуется очень высокая скорость считывания, которая у многоканальных спектрометров составляет 50 Гц. Таким образом, каждые 20 мс измеряется один спектрспектр, и из полученных спектров в режиме онлайн конструируется хроматограмма при определенной длине волны. С такой скоростью считывания, во&первых, возможена количественная обработ& ка пиков, имеющих полуширину на уровне нескольких секунд, кроме того, нет опасности искажения спектров, записанных «онлайн». Здесь также важно, что детектирование может проводиться с высокой чувствительностью, так как за этот короткий временной интервал едва ли есть возможность для сглаживания и ус& реднения спектров по времени.

Благодаря большому массиву данных экспериментатор получает максимальную информацию о поглощении элюента, выходящего из колонки, в ходе анализов, тем не менее, ему было бы трудно выделить из этого массива важную для него инфор& мацию. Только если эти методы поддерживаются не только в диалоговом, но и в автоматическом режиме сохранения, они могут применяются в рутинном анализе. Поэтому цель автоматической обработки данных должна состоять в том, чтобы об& легчить эту работу пользователю или, где это возможно, устранить ее полностью. Детектор с диодной линейкой должен быть полностью интегрирован с программой управления и обработки данных ВЭЖХ, тогда высокая ценность документации и защита результатов реализуются без дополнительных затрат на персонал.

Перед анализом пользователь может свободно выбрать до восьми длин волн для одновременного детектирования. Любая из этих длин волн может использо& ваться также как длина волны сравнения. Измеренное при этом поглощение ав& томатически вычитается из поглощения при других длинах волн. Этот метод зна& чительно сокращает флуктуации базовой линии, которые возникают из&за меша& ющих факторов (например, колебаний температуры), которые никак не связаны с используемыми длинами волн.

Используя восемь различных длин волн, можно получать до восьми незави& симых сигналов, причем длины волн могут быть произвольно запрограммирова& ны во времени, что соответствует восьми многоканальным детекторам. Парал& лельно этому спектры поглощения могут либо сохраняться, либо выводиться на экран. Момент записи спектров определяется либо оператором, либо автомати& чески самим устройством. Пользователь может решать, должны ли быть записа& ны спектры для максимумов пиков или для максимумов и точек перегиба пиков. Записанные УФ спектры пиков автоматически сравниваются со спектрами из биб& лиотеки спектров. Если спектры совпадают, то идентифицированные пики на хро& матограмме помечаются названием компонента наилучшего соответствия, как, например, представлено на рис. 4.26.

Пик считается идентифицированным тогда, когда время удерживания и со& впадение спектров превосходят минимальный критерий, который устанавлива& ется пользователем. Чтобы удостовериться, что нет никаких неразрешенных пи& ков, «контроль чистоты» проводится перед каждым библиотечным поиском. При этом спектры пиков, полученные в точках перегиба восходящей и нисходящей частей пика и в максимуме пика, нормируются и сравниваются [4.19].