Бёккер_Хроматография [2009]

70 Глава 3. Газовая хроматография

Слой полиимида

Плавленый кварц

Стационарная фаза

Рис. 3.5. Сечение капиллярной колонки

При постановке определенной задачи это дает возможность правильно выб& рать колонку. Например, если нужно повысить емкость колонки, то этого можно достичь, используя колонку большего внутреннего диаметра и соответственно с более толстой пленкой стационарной фазы. Для увеличения эффективности раз& деления, наоборот, выбирают колонку с меньшим диаметром внутреннего сече& ния и, соответственно, более тонкой пленкой. В обоих случаях величина β и ха& рактеристики разделения остаются постоянными.

3.3.3.Выбор колонки

Внастоящее время в обращении имеется около 500 различных хроматографичес& ких фаз. Неправильный выбор особенно часто делают начинающие хроматогра& фисты, если у них нет в распоряжении подробной информации о свойствах ста& ционарной фазы или соответствующего литературного руководства. Опыт пока& зал, что 90% всех проблем разделения, встречающихся в обычной лабораторной практике газовой хроматографии, можно решить с помощью пяти стационарных жидких фаз разной полярности. Благодаря высокой разделяющей способности современных хорошо дезактивированных капиллярных колонок в большинстве случаев можно уже не использовать различия в селективности. Смена полярнос& ти всегда рекомендуется в том случае, если хорошее разделение удается достичь лишь при длительном времени анализа [3.3].

Из широкого ряда предлагаемых хроматографических фаз примерно 30 ис& пользуются особенно часто. При этом определенные фазы имеют огромное зна& чение лишь для небольшого круга пользователей. Поэтому деление фаз на важ& ные и неважные, в принципе, невозможно. Для ряда задач производители коло& нок предлагают специальные колонки, как, например, для разделения углеводов, пестицидов, триглицеридов и т.д.

Различные заместители в химической структуре стационарных фаз определяют вид взаимодействия (избирательности) между фазой и разделяемыми веществами и, таким образом, определяют их относительное удерживание. В качестве стационар& ных фаз применяют различные силоксаны, такие как диметил&, фенил& и цианопро&

пилсилоксаны, а также их смеси, что позволяет варьировать полярность стационар& ной фазы. Другой тип стационарных фаз представлен полиэтиленгликолями (ПЭГ).

Если нет специальных колонок, а в литературе отсутствует соответствующее приложение, то нужно попытаться разделить пробу на той колонке, которая сто& ит в газовом хроматографе. Ввиду высокой разделяющей способности современ& ных капиллярных колонок есть хороший шанс для успешного разделения. Вслед& ствие высокой инертности колонок из плавленого кварца и в отличие от запол& ненных колонок тип стационарной фазы в большинстве случаев не является ре& шающим фактором. Основное правило, которое указывает на то, какая колонка могла бы быть использована для разделения, гласит: подобное растворяется в по& добном, соответственно, Цицерон (умер в 43 г. до нашей эры) говорил: подобное с подобным соединяется охотно.

Неполярные компоненты нужно делить на неполярной колонке, а полярные – на полярной.

В табл. 3.1 дан небольшой обзор разделений на капиллярных колонках.

Таблица 3.1. Примеры разделений на различных капиллярных колонках

В большинстве случаев для разделения достаточно капиллярной колонки дли& ной 25 м. Если разделение все же недостаточно хорошее, можно взять более длин& ную 50&метровую колонку. Еще более длинные колонки использовать не стоит, так как удвоение длины увеличивает разделение лишь на 40%, так как эффектив& ность пропорциональна корню квадратному из длины колонки. С другой сторо& ны, если на 25&метровой колонке пики очень хорошо разделены, то можно умень& шить время анализа, укоротив колонку до 10 м.

Колонки из плавленого кварца производятся пяти различных диаметров:

•мегаколонки с внутренним диаметром 0,53 мм являются альтернативой на& бивным колонкам. Их преимущество состоит в том, что при равной разделя& ющей способности время анализа на этих колонках значительно меньше;

•широкие колонки (внутренний диаметр 0,32 мм) и узкие колонки (внут& ренний диаметр 0,25 мм) подходят для решения большинства задач в ка& пиллярной ГХ;

•миниколонки (внутренний диаметр 0,18 мм) имеют очень высокое разре& шение и/или наибольшую скорость анализа. Эти колонки рекомендованы для ГХ/МС;

•микроколонки, применяются, как правило, в сверхкритической флюидной хроматографии, однако они могут использоваться в качестве высокоэффек& тивных колонок и в ГХ, но к системе ввода пробы в этом случае предъявля& ются особые требования.

Капиллярные микроколонки обладают очень высокой разделяющей эффек& тивностью в единицу времени, но требуют аналитических приборов, которые со& ответствуют самому современному состоянию техники. Они не очень просты в управлении. Мини& и стандартные капиллярные колонки требуют газовых хро& матографов, оснащенных для работы с капиллярными колонками (газовая хро& матография высокого разрешения ВРГХ). Они используются в большинстве ана& литических лабораторий. Капиллярные мегаколонки не требуют никаких специ& альных ГХ приборов и могут заменить большую часть еще до сих пор используе& мых наполненных колонок.

В табл. 3.2 показано влияние сечения колонки на эффективность разделения, емкость колонки и необходимое приборное оснащение.

Если точно неизвестно, какую колонку следует выбрать, то выбор может стать действительно мучительным делом. Обычно задают следующие вопросы:

•Нужно выбрать полярную или неполярную колонку?

•Какой Id и какая толщина пленки лучше подходят для пробы?

•30& или 60&метровую колонку нужно выбрать?

Некоторые аналитики не могут выбирать из разных типов колонок, так как в используемом ими протоколе анализа описана какая&то специальная колонка. Другие используют одну и ту же колонку для разных анализов, так как эта колон& ка, по крайней мере, надежно работает, хотя и не является лучшей для каждой пробы. Правильный выбор и оптимизация полярности колонки, диаметра колон& ки, толщины пленки стационарной фазы и длины колонки значительно повыша& ют производительность колонки и надежность аналитических данных.

3.3.3.1. Полярность фаз

Полярность фаз оказывает большое влияние на разделение химических соедине& ний. Только после того как полярность колонки была выбрана, могут быть оптими& зированы диаметр колонки, толщина пленки стационарной фазы и длина колон& ки. Часто только с помощью правильного выбора полярности колонки удается про& вести разделения, которые не могут быть выполнены с менее подходящей колон& кой независимо от того, какая у нее длина, толщина пленки или число теоретических

тарелок. Полярность колонки влияет также на температуру анализа. Например, если полярные компоненты анализируются на неполярной колонке, они будут удержи& ваться слабо, и температура колонки должна быть сильно понижена.

Полярность колонки зависит от того, каким образом компоненты пробы всту& пают во взаимодействие со стационарной фазой колонки. Стационарные фазы, с которых разделяемые компоненты элюируются в соответствии с их температура& ми кипения, считаются в общем случае неполярными. С ростом полярности ме& ханизм удерживания становится более сложным. Колонки со средней полярнос& тью удерживают компоненты пробы как исходя из температур кипения, так и по степени взаимодействия индуцированных диполей или способности к образова& нию водородных связей. Механизм разделения на полярных и сильно полярных фазах основывается почти исключительно на взаимодействии функциональных групп пробы с функциональными группами фазы.

Неполярные фазы более стабильны и обладают более высокой термической устойчивостью. Неполярные фазы дают, как правило, более высокую эффектив& ность разделения, чем полярные фазы. Неполярные фазы являются более устой& чивыми к окислению, чем полярные. Они допускают хранение без особых предо& сторожностей и не так сильно, как полярные фазы, чувствительны к попаданию воздуха в ГХ&систему.

Полярные колонки удерживают полярные вещества дольше, чем неполярные. Ме% ханизм разделения основан на специфическом взаимодействии функциональных групп стационарной фазы и пробы, тогда как неполярные колонки делят компоненты про% бы в первую очередь по их температурам кипения.

3.3.3.2. Внутренний диаметр колонки

Диапазон концентраций ключевых компонентов является важнейшим критери& ем для выбора оптимального внутреннего диаметра колонки. В качестве диапазо& на концентраций берут область между наименьшей и наивысшей концентрация& ми различных компонентов, которые нужно количественно определить в одной пробе в ходе анализа.

Например, в пробе углеводородов ключевые компоненты представлены в концентрациях 0,1 мг/мл и 100 мг/мл, так что диапазон концентраций составляет 1 : 1000. Когда вводят 1 мкл с делением потока 1 : 100, то количества, которые в конечном счете достигнут колонки, лежат между 1 нг (для компонентов с наи& меньшими концентрациями) и 1000 нг (для компонентов с наивысшими концент& рациями). В этом случае лучшим выбором является колонка с диаметром 0,53 мм, так как она позволяет работать с таким широким диапазоном концентраций, по& скольку обладает нагрузочной емкостью > 1000 нг.

Существенным моментом является, таким образом, то, что наиболее высокая концентрация компонентов пробы не должна превышать максимальную емкость колонки, которая зависит от внутреннего диаметра колонки. Если емкость ко& лонки превышена, то передний край пика не симметричен заднему, а форма не соответствует распределению Гаусса. Перегруженные пики (с искаженным фрон& том) показывают наклоненный и растянутый передний край, тогда как задний

74 Глава 3. Газовая хроматография

Рис. 3.6. Фронтование и хвостование пиков

край имеет правильную форму. Максимум этого перегруженного пика, кроме того, немного смещен относительно обычного положения.

Обратным эффектом является образование «хвостов». Это часто наблюдает& ся, когда активные вещества адсорбируются на поверхности колонки. В общем случае, пики с «хвостами» ведут к большим временам удерживания. Большинство интеграторов могут количественно обработать площади пиков с небольшими эф& фектами перегрузки. На рис. 3.6 представлены различные формы пиков. Количе& ственное определение в этом случае не должно, однако, основываться на высоте пика, так как это дает особенно неточный результат.

Таким образом диаметр колонки выбирают соответственно сложности пробы

иее концентрации:

•пробы с сильно различными концентрациями каждого компонента требу& ют колонок с большим сечением, так как необходима высокая нагрузочная емкость;

•пробы с близкими концентрациями каждого компонента можно анализи& ровать на колонках любого диаметра, если концентрации невелики;

•для проб, содержащих следовые количества компонентов в диапазоне кон& центраций, близком к пределу обнаружения, нужно применять колонки с

Id 0,32 или 0,53 мм. Они позволяют больший массовый поток, который не& обходим для переноса большой пробы и кроме того для них меньше влия&

ние мертвого объема;

•применение ГХ/МС может сделать необходимым выбор колонки с Id 0,18 или 0,25 мм, чтобы не превышать производительность насоса;

•сложные пробы требуют большей эффективности для разделения компо& нентов, элюируемых близко друг к другу.

3.3.3.3. Оптимальная толщина пленки

Толщина пленки оказывает непосредственное влияние на удерживание и темпе& ратуру элюирования каждого отдельного компонента пробы. Пленки большей

толщины дольше удерживают вещества и повышают температуру, необходимую для элюирования каждого компонента. Пленки меньшей толщины позволяют быстрее элюировать вещества и снижают температуру элюирования.

•Для низкокипящих веществ нужно использовать более толстые пленки, чтобы оптимизировать их взаимодействие со стационарной фазой и, вмес& те с тем, повысить удерживание и температуру элюирования.

•Очень толстые пленки (3,0 или 5,0 мкм) должны использоваться для ве& ществ, которые анализируются при температурах близких к (или ниже) ком& натной.

•Толстые пленки (1,0 или 1,5 мкм) используются для проб, элюируемых при 100–200 °C.

•Пленки стандартной толщины (0,25 или 0,5 мкм) подходят для проб, кото& рые элюируются до 300 °C.

•Более тонкие пленки (0,1 мкм) идеально подходят для высокомолекуляр& ных соединений, которые элюируются при температурах выше 300 °C.

3.3.3.4. Выбор длины колонки

Более длинные колонки обеспечивают большую эффективность разделения, уве& личивая, однако, время анализа и его стоимость. Аналитик должен, таким обра& зом, решить, перевешивает ли преимущество более длинной колонки и получен& ное при этом дополнительное разрешение снижение производительности колонки как следствие увеличения ее длины. Преимущества использования более длинной колонки различны для изотермических анализов или анализов с программирова& нием температуры.

100 000 теоретических тарелок можно получить как на 10&метровой капил& лярной колонке с Id 0,1 мм, так и на 50&метровой колонке с Id 0,53 мм.

При изотермическом анализе разделение растет пропорционально квадрат& ному корню из длины колонки, а длительность анализа – прямо пропорциональ& на длине колонки. Это значит, что удвоение длины колонки (например, от 30 до 60 м) повышает разделение примерно на 40%, но время анализа увеличится вдвое.

В анализах с программированием температуры улучшение разделения сопро& вождается лишь небольшим увеличением времени анализа, так как этот вид ана& лизов позволяет веществам элюироваться, в первую очередь, согласно темпера& туре колонки. Если проба анализируется на 30&метровой и 60&метровой колонке с точно совпадающими температурными профилями, то формально на 60&метро& вой колонке компоненты пробы выходят из колонки при более высоких темпера& турах. Таким образом, сокращается время анализа.

Чаще всего используют колонки длиной 30 м. Примерно 50% всех колонок в лабораториях имеют такую длину. Этих колонок обычно достаточно для разделе& ния большинства проб, и они обеспечивают наилучший компромисс, позволяю& щий сократить время анализа. Длины от 15 м применяют для быстрого скринин& га, простых смесей или исключительно высокомолекулярных веществ. Колонки длиной 60 и 100 м нужно использовать, если требуется максимальная эффектив& ность разделения для пробы исключительной сложности.

76 Глава 3. Газовая хроматография

•Анализы с программированием температуры с длинными колонками обес& печивают значительное улучшение разрешения, не вызывая заметного по& вышения времени анализа.

•Для изотермических анализов более длинные колонки не всегда предпоч& тительны, так как время анализа удваивается с удвоением длины колонки.

3.3.3.5. Анализ газов

Смеси газов разнообразного состава находят сегодня широкое применение в про& мышленности, например, в качестве защитного, реакционного или горючего газа. Примерами являются использование газа для получения тепла или в таких термических процессах, как сварка, плавка или сушка продуктов. Для анализа газов существует множество методов. Газовая хроматография наряду со спект& роскопическими методами принадлежит к числу наиболее широко используе& мых методов.

Название «газовая хроматография» говорит о том, что подвижная фаза – газ и перенос вещества в колонке происходит вблизи или слегка ниже температуры кипения вещества. Такие газы, как азот, кислород, окись углерода и углекислый газ, находятся, однако, уже при комнатной температуре далеко от их температур кипения. Поэтому для ГХ&разделения таких газов необходимы особые приемы. Анализ газов с помощью ГХ проводится в общем случае методами газоадсорбци& онной хроматографии. В то время как для жидких проб действует правило:

Использовать колонки с полярностью, равной полярности пробы, и проводить разделение при температуре кипения пробы,

оно не работает при анализе газов. Разделение газов происходит путем адсорбции на твердом носителе при температурах, которые лежат намного выше точек ки& пения.

Многие проблемы в анализе газов не могут быть решены традиционными ме& тодами – изменением температуры или выбором другой колонки. Хорошим при& мером тому является разделение кислорода, азота и диоксида углерода. Разделе& ние О2 и N2 при температурах выше комнатной возможно только на молекуляр& но&ситовых колонках, где время удерживания СО2 все же столь велико, что часто воспринимается как необратимая адсорбция. Существует много колонок, кото& рые могут отделять СО2 от воздуха, но все же ни одной, на которой одновременно все три компонента могут быть разделены для правильного количественного оп& ределения [3.8].

3.3.4. Переключение колонок

ГХ&анализ очень сложных смесей, которые содержат многочисленные, в том чис& ле, изомерные компоненты различных классов веществ с различной летучестью, не приводит при однократном газохроматографическом разделении к получению достаточной информации о составе пробы и, тем более, к ее полному качествен& ному и количественному анализу. Смеси природных веществ, например, нефти, содержат много сотен компонентов. Ни одна капиллярная колонка не может раз&

делить в одном анализе эти компоненты. Под каждым пиком всегда скрываются другие пики. В этом случае требуется многократное повторение хроматографи& ческого разделения с изменением хроматографических параметров. И это об& стоятельство не может изменить ни использование капиллярных колонок спе& циальной полярности с очень высокой эффективностью разделения, ни приме& нение температурного программирования, соответствующего диапазону лету& чести пробы.

Больше и лучшего качества информацию о пробе можно получить путем од& новременного проведения анализа пробы на двух колонках различной полярнос& ти и с использованием двух параллельных детекторов, например, селективного и неселективного. Время реального ГХ&анализа можно сократить, если отказаться от полного анализа и проводить только частичный анализ выбранных значимых компонентов (в смысле разделения и селективного детектирования). Хорошим примером частичного анализа является анализ равновесного пара методом газо& вой хроматографии «Headspace», при котором анализируются только летучие ком& поненты, которые с достаточным давлением пара представлены в поровом про& странстве сосуда с пробой. При такой селективной подаче пробы более тяжелые или нелетучие компоненты вообще не попадают в хроматографическую систему. Это сокращает время анализа и предотвращает загрязнение системы.

При многомерной газовой хроматографии колонки включаются в серию. Каж& дая группа веществ может тогда разделяться на специально выбранной фазе. Эф& фективность разделения при этом умножается. В предколонке такой системы мож& но проводить предварительное или групповое разделение, выход также может кон& тролироваться монитором&детектором. Только часть элюата предколонки с по& мощью таймера и переключателя колонок вырезается и переносится в рабочую колонку, где начинается новое разделение при другой температуре, другой эф& фективности разделения и другой полярности. Неинтересные и мешающие пло& хо& или легколетучие примеси (а также растворитель) одновременно или после предварительного разделения удаляются из системы перед пробой или, наоборот, за пробой (обратная продувка) и не достигают рабочей колонки и детектора [3.10].

На рис. 3.7 представлен пример системы с переключением колонок с обрат& ной промывкой пробы в аналитическую колонку. Эта техника представляет аль& тернативу многократному анализу и позволяет одновременно определять сильно различающиеся классы веществ. Эта система подходит также для оптимального разделения смесей сильнополярных и неполярных компонентов. Для каждой груп& пы можно выбрать соответствующую аналитическую колонку. При этом важным является то, что первая колонка делит обе группы веществ друг от друга. С помо& щью правильного выбора длины колонки и диаметра сечения, так же как скорос& ти потока, при одновременном анализе на обеих колонках можно избежать одно& временно элюируемых пиков, а также падения давлений и градиентов потока.

Комбинированные системы колонок могут использоваться также для подго& товки проб. Так как емкость каждой колонки ограничена, на колонку может быть нанесено только определенное количество вещества. Для анализа следовых ко& личеств дополнительно должно проводиться обогащение пробы, которое может быть осуществлено с помощью системы колонок. Достаточное количество пробы

78 Глава 3. Газовая хроматография

Рис. 3.7. Система для анализа сложных смесей, обратная промывка аналитической колонки

вносится в первую капиллярную колонку, которая допускает значительную пере& грузку. Фракции, содержащие определяемые компоненты, вырезают и делят на второй капиллярной колонке [3.11].

3.4. Термостаты

Впроцессе ГХ разделения участвуют только те компоненты смеси, давление пара которых над используемой стационарной фазой достаточно велико, чтобы пере& нос вещества в мобильной фазе вообще мог происходить с приемлемой скорос& тью, то есть разделение и анализ, соответственно, проходили за разумное время. Температура колонки влияет на абсолютную и относительную хроматографичес& кую летучесть разделяемых компонентов и, тем самым, на разрешение и время разделения. Летучесть высокомолекулярных или сильнополярных соединений, конечно, можно увеличить повышением температуры колонки. Температура ко& лонки наряду с выбором подходящей стационарной фазы и оптимальной скорос& ти потока газа&носителя является важнейшим параметром, который должен быть оптимизирован для практического разделения, то есть должен быть подобран для пробы определенного состава. Полное время анализа и хроматографическое раз& решение сильно зависят, таким образом, от температуры колонки.

Выбор рабочей температуры определяется следующими факторами:

•диапазон летучести компонентов анализируемой смеси. Летучесть опреде& ляется давлением пара компонентов и их растворимостью в стационарной фазе;

•длина колонки и еще приемлемая максимальная длительность анализа;

•количество стационарной фазы в колонке, как абсолютное, так и относи& тельное по сравнению со свободным объемом колонки.

Если разделение компонентов смеси не представляет трудностей, то скорость разделения можно повысить, подняв температуру колонки. Такой подход эконо& мит время анализа. Температуру все же не следует поднимать слишком высоко, так как при этом селективность разделения важных пар веществ будет слишком низкой и, кроме того, лабильные компоненты смеси подвергаются термическому распаду. В общем случае разделение проводят при температурах, которые лежат несколько ниже точки кипения наиболее трудно разделяемых компонентов. По& скольку в капиллярных колонках находится очень малое количество стационар& ной фазы, то капиллярная хроматография может проводиться при более низких температурах, чем в случае заполненных колонок. Это означает, что температура колонки может быть почти на 100 °C ниже точки кипения наиболее высоко кипя& щего компонента. Используя короткие капиллярные колонки с тонкими пленка& ми термически устойчивых стационарных фаз, можно добиться элюирования очень трудно летучих соединений при температурах ниже 300 °C.

В принципе, колонки могут работать либо в изотермическом режиме, либо в режиме программирования температуры. При повышении температуры повыша& ется давление пара хроматографируемых компонентов. Соответственно их перенос по колонке происходит быстрее. Пробы, исследуемые на практике, как правило, являются смесями компонентов с различными температурами кипения. В изотер& мическом режиме колонка находится при постоянной температуре, при которой либо более летучие компоненты не разделяются, либо труднолетучие компонен& ты удерживаются очень сильно или не элюируются совсем. Найти оптимальную температуру для разделения большого числа пар веществ с различными диапазо& нами летучести, как правило, невозможно. Такое разделение все же можно про& вести в режиме программирования температуры.

Ввиду того, что время удерживания гомологов возрастает логарифмически с ростом числа атомов углерода, продолжительность анализа сильно возрастает, если проба наряду с низкокипящими компонентами, которые для своего разделения требуют низкой температуры, содержат также вещества с большой молекулярной массой и, соответственно, более высокими температурами кипения. В этих слу& чаях используют программирование температуры, то есть повышают температу& ру колонки в процессе разделения. Таким образом, низкокипящие и вместе с тем быстроэлюируемые компоненты будут в достаточной степени разделены при низ& ких температурах колонки, тогда как элюирование высококипящих компонентов будет ускорено повышением температуры при дальнейшем анализе. Ширина пи& ков поздноэлюируемых компонентов сужается до «нормальной» величины, и ве& щества могут быть идентифицированы с большей точностью и надежностью.

Следует отметить, что более 80% всех разделений в ГХ проводятся в режиме программирования температуры и лишь небольшая часть – в изотермическом режиме. Конечно, при этом после каждого анализа и достижения максимальной температуры термостат нужно снова охладить для возвращения к начальным ус& ловиям. Для ускорения процесса охлаждения дверца термостата автоматически открывается и при достижении исходной температуры снова закрывается.

Термостат в ГХ должен удовлетворять трем важным требованиям, а именно: точности и воспроизводимости установления температуры и создавать возможно