стандарту становить 50 мл.
Готові стандартні розчини колориметрують на ФЕК.
Для побудови калібрувальної кривої на міліметровому папері проводять координатні осі. На осі абсцис відкладають значення концентрації стандартних розчинів біхромату калію, мкг/мл; на осі ординат– відповідні їм значення оптичної густини, отримані на ФЕК. Із знайдених точок проводять перпендикуляри до їхнього перетину. Отримані точки перетину з’єднують між собою. Ця лінія і буде калібрувальною кривою.
|
|
|
Таблиця 4.1 |
Приготування стандартних розчинів калій біхромату |
|||
Номер |
Основний розчин, |
Вода, мл |
Вміст каротину, |
розчину |
мл |
|
мкг/мл |
1 |
1 |
49 |
0,416 |
2 |
2 |
48 |
0,832 |
3 |
3 |
47 |
1,248 |
4 |
4 |
46 |
1,664 |
5 |
5 |
45 |
2,080 |
6 |
10 |
40 |
4,160 |
7 |
25 |
25 |
10,400 |
Аналізують одержані результати, складають висновки і рекомендації. |
|
||||||||||||
До |
4.7. Якісне визначення вітаміну D3 (холекальциферолу) |
сполук, |
що |
||||||||||
вітамінів |
групиD (кальциферолів) належать |
декілька |
|||||||||||
відрізняються за хімічною будовою та біологічною активністю. Для людини та |
|||||||||||||
тварин |
найбільше |
значення |
мають |
вітаміниD2 (ергокальциферол) та |
D3 |
||||||||
(холекальциферол). |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
Вітаміни |
D2 |
та D3 утворюються |
під дією УФ випромінювання з |
||||||||||
ергостерину |
та 7-дегідрохолестерину, |
відповідно. |
Вітаміни |
цієї |
групи |
||||||||
відповідають за фосфорно-кальцієвий обмін в організмі. |
|
|
|
||||||||||
|
|
|
|
|
СН3 |
|
|
СН3 |
СН3 |
|
|
||
|
|
|
СН2 |
|
|
|
СН – СН2 – СН2 – СН2 – СН – СН3 |
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
НО
Холекальциферол
Мета роботи:засвоєння методики якісного визначення вітаміну D3. Завдання на виконання роботи: провести якісне визначення вітаміну D3 у
риб’ячому жирі.
Апаратура: газовий пальник.
Лабораторний посуд: пробірки; піпетки.
Матеріали та реактиви: концентрована хлоридна кислота; нілін; риб'ячий жир.
Принцип методу. При нагріванні хлороформного розчину вітамінуD3 або
37
риб’ячого жиру із сумішшю аніліну та концентрованої хлоридної кислоти розчин забарвлюється у червоний колір.
Хід роботи. У суху пробірку наливають1 мл риб’ячого жиру, додають до нього 5 мл аніліну і 0,5 мл концентрованої хлоридної кислоти. Вміст пробірки нагрівають на відкритому полум’ї до кипіння протягом0,5 хв. Емульсія забарвлюється в червоний колір.
Аналізують одержані результати, складають висновки і рекомендації.
Запитання для самоперевірки
1.Що таке вітаміни?
2.На які групи поділяються вітаміни?
3.Що таке гіпер-, гіпота авітаміноз?
4.У чому полягає принцип кількісного визначення вітаміну С?
5.Охарактеризуйте принцип визначення каротинів.
|
|
|
|
5. ФЕРМЕНТИ |
|
|
|
|
|
||
Ферменти – біологічні каталізатори білкової природи. Їх поділяють на дві |
|
||||||||||
групи: однокомпонентні (прості ферменти), що складаються тільки з білка, і |
|
||||||||||
двокомпонентні (складні ферменти), які містять білок та активну групу |
|
||||||||||
небілкової природи. |
|
|
|
називаютькофакторами. |
|
|
|||||
Небілкові |
компоненти |
ферментів |
Кофактор, |
|
|||||||
зв'язаний |
із |
білковою |
|
частиною |
слабкими |
електростатичними |
|||||
вандерваальсівськими силами називають коферментом. Кофактор, який міцно |
|
||||||||||
зв’язаний ковалентними зв'язками з білком називаєтьсяпростетичною групою. |
|
||||||||||
До кофакторів також належатьактиватори |
ферментів, які |
прискорюють |
|||||||||
реакції, каталізовані ферментами. Активаторами часто є іони металів– магнію, |
|
||||||||||
цинку, мангану, кобальту тощо. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
Субстрат зв'язується не з усією молекулою ферменту, а |
з |
окремою |
її |
||||||||
ділянкою, яка називається активним центром. У складних ферментах активний |
|
||||||||||
центр утворений кофактором і залишками амінокислот; у простих ферментах |
|
||||||||||
активний центр представлений певною комбінацією залишків амінокислот. |
|
||||||||||
Теорія |
ферментативного |
каталізу полягає |
в тому, що великі |
швидкості |
|
||||||
ферментативних |
реакцій |
є |
результатом |
зниження |
енергії |
акти |
|||||
каталізованих |
реакцій. |
Саме |
завдяки тому, що біологічні |
каталізатори |
|||||||
знижують енергію активації, ферментативні реакції проходять з високою |
|||||||||||
швидкістю при відносно низькій температурі. |
|
|
|
|
|
||||||
Механізм дії простих і складних ферментів однотиповий, оскільки активні |
|
||||||||||
центри в їх молекулах функціонально схожі між собою. |
|
|
|
|
|||||||
Головну роль у механізмі ферментативного каталізу відіграє утворення |
|||||||||||
фермент–субстратних |
комплексів. На |
першому |
етапі |
ферментативного |
|||||||
каталізу фермент (Е) з'єднується із субстратом(S) з утворенням проміжного |
|
||||||||||
нестійкого фермент-субстратного комплексу(ЕS); на |
другому – |
відбувається |
|
||||||||
утворення |
активованого |
фермент-субстратного |
комплексу(ЕS*). |
На |
третьому |
|
|||||
етапі відбувається хімічна реакція; а на четвертому– відділення продуктів реакції (Р) від ферменту:
E + S Û ES ® ES * ® EP ® E + P
38
Активність ферментів характеризується швидкістю хімічних реакцій, що
вони їх каталізують, і виражається в |
одиницях, які |
називаються каталами |
||
(скорочено кат.). |
Катал – це каталітична активність, яка здійснює хімічне |
|||
перетворення 1 моля субстрату за секунду. |
|
|
|
|
Число одиниць ферменту, яке припадає на1 мг білка ферментного |
||||
препарату, називається питомою активністю. |
|
|
||
Молекулярна |
активність – це |
кількість |
молекул |
субстрату, яка |
перетворюється за 1 хв однією молекулою ферменту.
За міжнародною класифікацією ферменти поділені на шість класів.
1.Оксидоредуктази (окисно-відновні ферменти) – прискорюють процеси окиснення та відновлення речовин. В основі дії ферментів лежить перенесення водню чи електронів, або приєднання кисню.
2.Трансферази – каталізують перенесення різноманітних атомних груп з молекул одних сполук на інші. Існують різноманітні типи трансфераз, залежно від того, перенесення яких груп вони каталізють: амінотрансферази, фосфотрансферази, глікозилтрансферази тощо.
3.Гідролази – ферменти, які прискорюють реакції гідролізу, тобто процеси розщеплення органічних сполук за участю води. Найчастіше зустрічаються
гідролази, що впливають розщеплюють жири та інші розщеплюють вуглеводи та каталізують гідроліз білків і розщеплення амідів).
на |
зв:’язкискладноефірний |
(естерази, |
що |
складні ефіри), глікозидний |
(глікозидази, |
що |
|
їх |
похідні), пептидний (пептигідролази, |
які |
|
пептидів), амідний (амідази, |
що каталізують |
||
4.Ліази – каталізують реакції негідролітичного розщеплення речовин з утворенням подвійних зв’язків, а також приєднання груп за місцем подвійних зв’язків. До класу ліаз входять: декарбоксилази, що відщеплюють СО2 від карбоксильної групи органічних амінокислот; альдолази, що прискорюють реакції з утворенням альдегідів; дегідратази, що відщеплюють молекули води та інші.
5.Ізомерази – каталізують перетворення органічних сполук в їх ізомери.
Деякі |
з |
представників |
|
цього |
класу |
прискорюють |
цис-транс; -ізомері |
||||||
взаємоперетворення |
альдоз |
і |
,кетоза |
також |
|
внутрішньомолекулярне |
|||||||
перенесення радикалів. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
6. Лігази (синтетази) – |
каталізують |
реакції |
синтезу |
|
речовин |
з |
|||||||
використанням енергії розпаду АТФ. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
У кожному класі існує розподіл на підкласи і підпідкласи, які уточнюють |
|
||||||||||||
природу ферментативної реакції. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
|
5.1. Визначення специфічності дії ферментів |
|
|
|
||||||||
Ферменти |
відрізняються |
|
від |
неорганічних |
каталізаторів |
високо |
|||||||
специфічністю. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
Під специфічністю дії ферментів розуміють відповідну спрямованість їх |
|
||||||||||||
впливу |
на |
певний |
субстрат, групу |
субстратів, |
близьких |
за |
своїми |
||||||
властивостями, або певний тип зв’язку. Залежно від цього |
розрізняють |
||||||||||||
абсолютну, групову і стереохімічну (просторову) специфічність ферментів. |
|
||||||||||||
Абсолютною специфічністю називають здатність |
ферментів каталізувати |
|
|||||||||||
39
лише одну реакцію і діяти на один точно визначений субстрат. Прикладом є дія |
|
|||||||||||
ферменту уреази, який каталізує гідролітичне розщеплення сечовини на карбон |
|
|||||||||||
диоксид та аміак. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Групова специфічність характерна для ферментів, які діють на групу |
|
|||||||||||
субстратів, що мають однаковий тип зв’язку. До таких ферментів належать |
|
|||||||||||
естерази, які каталізують гідролітичне розщеплення складноефірного зв’язку; |
|
|||||||||||
пепсин, трипсин, хімотрипсин і ряд інших, які розщеплюють пептидні зв’язки у |
|
|||||||||||
білках і пептидах різного складу та будови. |
|
|
|
|
|
|
||||||
Стереохімічна (просторова) специфічність ферментів виявляється тоді, |
|
|||||||||||
коли вони |
діють |
тільки |
на один із просторових . |
ізомерівПросторова |
|
|||||||
специфічність характерна для ферменту -Dβ-глюкозооксидази, яка каталізує |
|
|||||||||||
окиснення лише β-D-глюкози і не діє на її стереоізомер. |
|
|
|
|
|
|||||||
Мета роботи: засвоєння методики визначення різних видів специфічності |
|
|||||||||||
ферментів. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Завдання на виконання роботи: визначити специфічність дії певних |
|
|||||||||||
ферментів на відповідні субстрати. |
|
|
|
|
|
|
|
|||||
Апаратура: термостат. |
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
Лабораторний посуд: піпетки; пробірки. |
|
|
|
|
|
|||||||
Матеріали |
та реактиви: 1 %–й розчин крохмалю; 1,0 %–й розчин |
|
||||||||||
пепсину; розчин |
уреази; амілаза |
солоду; 1,0 %–й розчин |
сечовини; 1,0 %–й |
|
||||||||
розчин фенолфталеїну; молоко; 1,0 %–й розчин йоду в калій йодиді. |
|
|
|
|||||||||
Принцип методу. Під дією уреази сечовина розкладається з утворенням |
|
|||||||||||
карбон диоксиду та аміаку, який зміщує реакцію середовища в лужних бік, що |
|
|||||||||||
визначають з допомогою індикатора фенолфталеїну. |
|
|
|
|
|
|||||||
Амілази каталізують гідролітичне розщеплення крохмалю до мальтози і |
|
|||||||||||
декстринів. Найбільш вивченими є α і β–амілази: α–амілаза розщеплює амілозу |
|
|||||||||||
та амілопектин безладно на велику кількість низькомолекулярних декстринів і |
|
|||||||||||
незначну кількість мальтози; β–амілаза каталізує гідролітичне розщеплення |
|
|||||||||||
кожного другого глікозидного зв'язку в амілозі з утворенням мальтози та |
|
|||||||||||
розщепленням |
|
кожного |
другого |
глікозидного |
зв’язку |
амілопектину |
до |
|||||
розгалуження з утворенням мальтози і незначної кількості високомолекулярних |
|
|||||||||||
декстринів. Отже, дію |
амілази можна |
визначити |
за |
зникненням |
синього |
|
||||||
забарвлення розчину крохмалю в присутності йоду. |
|
|
|
|
|
|||||||
Пепсин каталізує гідролітичне розщеплення пептидних |
зв’язків |
білків |
|
|||||||||
молока, що зумовлює його зсідання. |
|
|
|
|
|
|
|
|||||
Хід роботи. Готують дев’ять чистих пробірок. У перші три наливають по 5 |
|
|||||||||||
мл 1 %–го розчину крохмалю і декілька краплин1,0 %-го розчину йоду в калій |
|
|||||||||||
йодиді; у наступні три – по 5 мл 1,0 %–го розчину сечовини і по 3 краплини 1,0 |
|
|||||||||||
%–го розчину фенолфталеїну. У решту пробірок – по 5 мл молока. |
|
|
|
|||||||||
Пробірки групують по три. У кожній трійці знаходяться пробірки з різним |
|
|||||||||||
субстратом – з крохмалем, сечовиною та молоком. |
|
|
|
|
|
|||||||
У першу трійку вносять по 1 мл уреази, в другу – по 1 мл розчину амілази, |
|
|||||||||||
в третю – по |
1 |
мл |
1,0 %–го |
розчину |
|
пепсину. Всі |
пробірки |
витримують |
|
|||
протягом 15 хв |
при температурі37 °С, після чого перевіряють у них дію |
|
||||||||||
ферментів. Відмічають зміну забарвлення в пробірках з крохмалем і сечовиною |
|
|||||||||||
40