під дією відповідно амілази та уреази; зсідання молока у пробірці з пепсином. Аналізують одержані результати, складають висновки і рекомендації.

5.2. Якісне визначення дії β-фруктофуранозидази

Фермент β-фруктофуранозидаза (інвертаза, сахараза) належить до класу гідролаз. Він каталізує гідролітичне розщеплення вуглеводів(сахароза, рафіноза), які містять фруктозу у β-формі, розщеплюючи β-фруктозидний зв’язок Гідроліз сахарози супроводжується утворенням -Dα-глюкози і β-D- фруктози.

Мета роботи: засвоїти метод якісного визначення активностіb-

фруктофуранозидази у дріжджах.

Апаратура: термостат; центрифуга; водяна баня.

Лабораторний посуд: мірні колби; піпетки; пробірки; порцелянові ступки. Матеріали і реактиви: розчин тростинного цукру в буфері(рН 4,5) (у

колбу місткістю 1 л наливають 50 мл нормального розчину натрій оцтовокислого та 50 мл нормального розчину оцтової кислоти і доводять водою до позначки. В мірній колбі місткістю 1 л розчиняють буферною сумішшю 100 г тростинного цукру і доводять вміст колби цією ж сумішшю до позначки. Розчин зберігають на холоді(2 – 4 °С) або консервують толуолом, додаючи

сіль калію і натрію винної кислоти150і г хімічно чистого їдкого натру розчиняють у мірній колбі місткістю 1 л і доводять водою до позначки. Перший і другий розчини при проведенні реакції додають в однакових кількостях); дріжджі; пісок.

Принцип методу. Альдегідна група редукуючого цукру реагує з гідратом окису міді Сu(OH)2. Редукуючі цукри при цьому окиснюються у відповідні кислоти, а блакитний гідрат окису міді відновлюється в жовтий гідрат закису міді СuОН.

Фруктоза в розчині Фелінга переходить в альдозу під дією лугу та окиснюється в кислоту, яка містить на один атом карбону менше, ніж вихідний цукор.

Реакцію відновлення міді та окиснення альдегідної групи цукру можна подати таким чином, що альдегідна група редукуючого цукру окиснюється в кислоту: RCOH + O = RCOOH за рахунок кисню гідрату окису міді:

2 Cu(OH)2 → 2 CuOH + O + H2O

При нагріванні: 2 CuOH → H2O + Cu2O.

Хід роботи. 5 г свіжих пресованих дріжджів вміщують у порцелянову

Суміш залишають на 20 хв у термостаті при температурі25 – 30 °С і час від часу струшують. Суміш центрифугують. Центрифугат іноді дає опалесценцію,

41

що пояснюється вмістом у ньому деякої кількості глікогену.

У дві пробірки наливають по5 мл розчину сахарози в буфері. Потім швидко приливають по 1 мл центрифугату екстракту інвертази: в одну пробірку

– некип’яченого, у другу – попередньо прокип’яченого протягом5 хв і охолодженого. Суміші вміщують на 30 хв у термостат при температурі40 °С. Після вказаного терміну інкубації приливають по2 мл реактиву Фелінга (по 1 мл першого і другого розчинів). Рідину в пробірках кип’ятять. Там, де був

випадає значний червоний осад закису міді, який свідчить про ферментативне розщеплення сахарози.

Аналізують одержані результати, складають висновки і рекомендації.

5.3. Визначення залежності дії ферментів від температури і рН середовища

Ферменти чутливі до впливу температури. Температура, за якої фермент має максимальну активність, називається оптимальною температурою дії

ферменту. Температурний оптимум дії більшості ферментів тваринного походження становить 37 – 50 °С, а рослинного – 40 – 60 °С. При нагріванні вище оптимальної температури активність ферментів знижується, і при температурі 80 °С більшість ферментів інактивується внаслідок денатурації.

При температурах нижче 0 °С дія ферментів уповільнюється.

Ферменти чутливі до рН середовища. Концентрація водневих іонів діє на активний центр ферментів, змінюючи ступінь іонізації функціональних груп, що впливає на його форму. Це позначається на швидкості реакції. Для кожного

ферменту існує оптимальне значення . рННезначне відхилення рН від оптимального значення уповільнює або зупиняє дію ферментів.

Оптимальні значення рН для деяких ферментів: пепсин – 1,5 – 2,2; уреаза – 7,0; амілаза слини – 6,8; трипсин – 7,0 – 7,8; аргіназа – 9,5 – 9,9; амілаза солоду

– 4,4 – 4,7; ліпаза (насіння рицини) – 4,7 – 5,0; мальтаза (дріжджі) – 6,7 – 7,2; сахараза (дріжджі) – 4,6 – 5,0; каталаза – 7,0.

Мета роботи: дослідити залежність ферментативної активності від температури і рН.

Завдання на виконання роботи: проаналізувати вплив температури та рН на амілолітичну активність ферментного препарату.

Апаратура: термостат.

Лабораторний посуд: піпетки; пробірки; крапельниці.

Матеріали та реактиви: 1 %–й розчин крохмалю; розчин солоду; 1,0 %– й розчин йоду в калій йодиді; 1,0 н розчин хлоридної кислоти; 1,0 н розчин натрій гідроксиду.

Принцип методу ґрунтується на різному забарвленні розчину крохмалю йодом, яке залежить від ступеню його гідролізу амілазою при різних значеннях температури і рН середовища.

42

амілолітичних ферментів.

За одиницю амілолітичної активності прийнято таку кількість ферменту, що каталізує розщеплення1 г розчинного крохмалю до декстринів, які не забарвлюються йодом, за 1 год при температурі30 °С у чітко визначених умовах. Амілолітичну здатність (АЗ) препарату виражають числом указаних одиниць в 1 г сухого препарату чи 1в мл розчину. При такому способі

вираження АЗ безпосередньо показує скільки грамів крохмалю може бути прогідролізовано до нездатних забарвлюватись йодом декстринів 1 г препарату, культури чи 1 мл розчину за 1 год (в умовах, аналогічних умовам визначення).

Мета роботи: засвоїти методику визначення амілолітичної здатності ферментного препарату.

Завдання на виконання роботи: визначити амілолітичну здатність ферментного препарату за швидкістю гідролізу крохмалю до декстринів.

Апаратура: водяна баня; секундомір.

Лабораторний посуд: мірні колби; піпетки; пробірки; скляні палички. Матеріали і реактиви: 1,0 %–й розчин розчинного картопляного

43

крохмалю (наважку беруть з такого розрахунку, щоб в 100 мл розчину був 1 г сухого крохмалю, кількісно переводять її у велику склянку з киплячою водою,

розрахунку на який взята наважка крохмалю, додають буферний розчин у кількості 10 мл на 100 мл розчину і доводять до позначки дистильованою водою. Розчин крохмалю готують у день аналізу); буферний розчин: змішують рівні об’єми нормальних розчинів оцтової кислоти(58 мл льодяної оцтової кислоти в 1 л дистильованої води) та натрій оцтовокислого (82 г CH3COONa або 136,1 г CH3COONa.3H2O в 1 л води), рН = 4,7; основнй розчин йоду (1,4 г кристалічного йоду і 4,4 г калій йодистого розчиняють у малому об’ємі води і доводять об’єм розчину до100 мл, зберігають у темному місці); робочий розчин йоду готують в день аналізу(20 мл основного розчину йоду доводять дистильованою водою до 100 мл і на кожні 100 мл робочого розчину додають 4 г йодистого калію); розчин технічного амілосубтиліну (1:1000).

Принцип методу ґрунтується на гідролізі1,0 %–го буферного розчину крохмалю під впливом амілолитичних ферментів. Кінець реакції контролюють візуально за йодною пробою. За часом, протягом якого проходить розщеплення

мл 1,0 %–го розчину крохмалю і занурюють у водяну баню з температурою30 °С (±0,2 °С). Загальний об’єм реакційної суміші завжди має дорівнювати 30 мл, і якщо на аналіз беруть менше10 мл ферментного розчину, то об’єм, якого не достає, доповнюють дистильованою водою, яку приливають перед додаванням ферментного розчину.

Через 10 хв витримування в бані у колбу вносять ферментний розчин при

забарвлюються йодом, може становити від 3 до 20 хв, але надійніші результати отримують у межах від 5 до 15 хв.

Примітка. Якщо час зникнення забарвлення менше3 хв, то визначення повторюють з меншою кількістю розчину фермента, наприклад – 2 мл. У цьому разі в пробірку чи колбу з20 мл крохмалю вносять 8 мл дистильованої води.

44