розбавляти зовсім.
У разі зникнення забарвлення в межах3 – 5 хв проби відбирають кожні 15 с; 5 – 10 хв – кожні 30 с; а понад 10 хв – кожну хвилину.
Скляну паличку після кожної проби промивають дистильованою водою і витирають чистим некрохмаленим рушником.
Розрахунок АЗ проводять за формулою:
|
|
|
АЗ = |
0,2 ×60 ×1 |
= |
12 |
, |
|
|
|
|
(5.1) |
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||
|
|
|
|
|
a ×t |
|
|
a ×t |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
де 0,2 – кількість крохмалю в реакційній суміші, г; 60 – коефіцієнт перерахунку |
|
||||||||||||||||
на 1 год; а – кількість ферментного препарату, введеного в реакційну суміш, |
|
||||||||||||||||
грами повітряно–сухої речовини або мілілітри рідинних об’єктів; t |
– |
час, |
за |
|
|||||||||||||
який пройшло розщеплення крохмалю до нездатних забарвлюватися йодом |
|||||||||||||||||
продуктів, хв; 1 – перерахунок |
на 1 г |
повітряно–сухого |
препарату |
або1 мл |
|
||||||||||||
розчину. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Приклад розрахунку. Для аналізу беруть5 мл ферментного розчину при |
|
||||||||||||||||
розбавленні |
1:2000, |
що |
відповідає 0,0025 |
г |
препарату (1·5/2000)=0,0025 |
г). |
|
||||||||||
Забарвлення |
з |
йодом |
зникає |
6,5черезхв, |
тоді |
за |
|
формулою |
|||||||||
АЗ=12/0,0025·6,5=740. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
Аналізують одержані результати, складають висновки і рекомендації. |
|
|
|||||||||||||||
|
5.5. Визначення протеолітичної активності |
|
|
|
|
|
|||||||||||
Важливим етапом технології багатьох харчових виробництв є біохімічні |
|
||||||||||||||||
перетворення білків, які відбуваються під дією протеолітичних ферментів. В |
|
||||||||||||||||
основі визначення протеолітичної активності лежать різні принципи: зміна |
|
||||||||||||||||
фізико–хімічних властивостей субстратів; визначення зменшення кількості |
|
||||||||||||||||
субстрату; облік кількості продуктів протеолізу. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||
Контроль за зменшенням кількості субстрату |
дає |
змогу |
судити |
про |
|||||||||||||
активність |
протеїназ, |
оскільки |
при |
цьому |
визначається |
кількіст |
|||||||||||
непрогідролізованого |
|
білка. Тому |
метод |
можна |
використовувати |
для |
|||||||||||
препаратів, які застосовуються в різних галузях промисловості. |
|
|
|
|
|
||||||||||||
Мета роботи: засвоїти методику визначення протеолітичної активності |
|
||||||||||||||||
ферментного препарату. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
Завдання на виконання роботи: визначити протеолітичну активність |
|
||||||||||||||||
ферментного препарату дією його на розчин казеїну. |
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||
Апаратура: водяна баня. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
Лабораторний посуд: мірні колби місткістю100 мл; піпетки; лійки для |
|
||||||||||||||||
фільтрування; скляні палички; крапельниці. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||
Матеріали і реактиви: 5 %–й лужний розчин казеїну: 50 г (за сухою |
|
||||||||||||||||
речовиною) технічного подрібненого казеїну вносять у склянку, додають для |
|
||||||||||||||||
набрякання 50 мл дистильованої води та залишають на30 хв, потім склянку |
|
||||||||||||||||
розміщують |
у водяній |
бані |
з температурою65 – |
70 |
°С. Поступово |
при |
|
||||||||||
ретельному помішуванні скляною паличкою, додають 50 мл 1 н розчину натрій гідроксиду. У процесі розчинення казеїну додають невеликими порціям воду(5
– 6 разів по 50 – 80 мл), нагріту до температури 65 – 70 °С, та витримують у водяній бані до зникнення грудочок. Після розчинення казеїну та охолодження об’єм розчину доводять в мірній колбі до1 л, фільтрують через чотири шари
45
марлі; 0,1 н розчин хлоридної кислоти в 7,5 %–му розчині натрій сульфату; 0,1 |
|||||||||
н розчин натрій гідроксиду; фільтрувальний |
папір; індикатор – 0,5 %–й |
||||||||
спиртовий розчин крезолроту; розчин технічного протосубтиліну (1:100). |
|
||||||||
Принцип |
методу |
полягає |
в |
гідролізі |
казеїну |
відомою |
кількістю |
||
ферментного |
препарату |
і |
визначенні |
ступеню |
розщеплення |
білка |
|||
зменшенням кількості хлоридної кислоти, що зв’язується непрогідролізованим |
|||||||||
казеїном. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Хід роботи. У колбу(плоскодонну чи |
конічну) |
місткістю 100 |
мл |
||||||
набирають піпеткою 20 мл розчину |
казеїну і |
занурюють |
у водяну |
баню з |
|||||
температурою 30 °С (± 0,2°). Через 10 хв наливають |
при |
помішуванні10 мл |
|||||||
ферментного розчину. Весь об’єм (казеїн і ферментний розчин) має становити |
|||||||||
30 мл. Якщо на аналіз береться менше 10 мл ферментного розчину, об’єм, якого |
|||||||||
не достає до 30 мл, заповнюють дистильованою водою, яку приливають перед введенням ферменту.
Через 1 год у колбу приливають (теж при помішуванні) піпеткою 20 мл 0,1 н розчину хлоридної кислоти в7,5 % натрій сульфаті та фільтрують до повної прозорості (повертаючи фільтрат на фільтр).
Контрольний дослід ставлять таким же чином, тільки до |
введення |
ферментного розчину додають суміш хлоридної кислоти7,5 з% |
натрій |
сульфатом і колбу не витримують у водяній бані, а відразу фільтрують. |
|
У 20 мл фільтрату контролю та досліду відтитровують0,1 н розчином натрій гідроксиду надлишок хлоридної кислоти. Титрують у присутності двох краплин 0,5 %–го спиртового розчину крезолроту до червоного забарвлення. Різниця титрувань (дослід – контроль), перерахована на 10 мл фільтрату, може становити 0,4 – 2,5 мл. Якщо вона менша за0,4 чи більша 2,5 мл, то аналіз повторюють з більшим чи меншим дозуванням ферменту, змінюючи кількість ферментного розчину чи його розбавлення.
Розрахунок активності. За різницею титрувань досліду і контролю в мл
0,1 н натрій гідроксиду, яку перераховують на10 мл фільтрату, |
знаходять |
|
|||||||
одиниці |
активності |
за табл. 5.1. У таблиці |
наведено |
також значення |
|||||
протеолітичної активності за умов, що на аналіз було взято 10 мл ферментного |
|
||||||||
розчину в розбавленні 1:100 чи 1:50. |
|
|
|
|
|
|
|
||
Для |
інших |
кількостей |
ферментного |
розчину |
чи |
інших |
розведе |
||
протеолітичну активність перераховують за формулою: |
|
|
|
||||||
|
|
|
ПА = |
е |
, |
|
|
(5.2) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
а |
|
|
|
|
|
де е – кількість одиниць, знайдена за табл. 5.1 згідно з результатами титрування; а – наважка препарату (г, мл), яка відповідає 10 мл фільтрату (1/5 всієї кількості, взятої на аналіз).
Приклад розрахунку. 1. Для аналізу брали10 мл ферментного екстракту 1:50. На титрування досліду витратили 4,2 мл 0,1 н розчину натрій гідроксиду, на титрування контролю– 2,0 мл. Різниця титрувань перерахована на10 мл фільтрату (4,2 – 2,0) : 2 = 1,1 мл 0,1 н розчину натрій гідроксиду. Величина 1,1 відповідає, за табл. 5.1, ПА = 1,868.
2. Для аналізу брали 5 мл розчину очищеного препарату1:1000. Різниця
46
титрувань досліду і контролю дорівнює 1,8 мл 0,1 н розчину натрій гідроксиду. Величина 1,8 відповідає, за табл. 5.1, 0,1353 од.
У 5 мл розчину 1:1000 міститься 0,005 г ферменту. Ці 0,005 г містяться в 50 мл реакційної суміші, а в 10 мл ферменту – 0,001 г:
ПА = 0,1353 =135,3 0,001
Таблиця 5.1
Протеолітична активність (перерахунок на повітряно-суху речовину)
0,1 н. NaOH, мл, |
Одиниці |
ПА при введенні 10 мл розчину |
|
на 10 мл фільтрату |
протеолітичної |
при розбавленні |
|
|
активності, е |
|
|
|
1:100 |
1:50 |
|
|
|
||
1 |
2 |
3 |
4 |
0,30 |
0,0123 |
0,615 |
0,300 |
0,35 |
0,0167 |
0,835 |
0,418 |
0,40 |
0,0203 |
1,015 |
0,508 |
0,45 |
0,0243 |
1,215 |
0,608 |
0,50 |
0,0283 |
1,415 |
0,708 |
0,55 |
0,0320 |
1,600 |
0,800 |
0,60 |
0,0360 |
1,800 |
0,900 |
0,65 |
0,0393 |
1,965 |
0,982 |
0,70 |
0,0433 |
2,165 |
1,082 |
0,75 |
0,0473 |
2,365 |
1,182 |
0,80 |
0,0513 |
2,565 |
1,282 |
0,85 |
0,0550 |
2,750 |
1,375 |
0,90 |
0,0590 |
2,950 |
1,475 |
0,95 |
0,0627 |
3,135 |
1,573 |
1,00 |
0,0667 |
3,335 |
1,663 |
1,05 |
0,0700 |
3,500 |
1,750 |
1,10 |
0,0747 |
3,735 |
1,868 |
1,15 |
0,0787 |
3,935 |
1,968 |
1,20 |
0,0827 |
4,135 |
2,068 |
1,25 |
0,0867 |
4,335 |
2,168 |
1,30 |
0,0907 |
4,535 |
2,268 |
1,35 |
0,0950 |
4,750 |
2,375 |
1,40 |
0,0990 |
4,950 |
2,475 |
1,45 |
0,1033 |
5,165 |
2,582 |
1,50 |
0,1080 |
5,400 |
2,700 |
1,55 |
0,1123 |
5,616 |
2,808 |
1,60 |
0,1167 |
5,835 |
2,918 |
1,65 |
0,1213 |
6,065 |
3,032 |
1,70 |
0,1260 |
6,300 |
3,150 |
1,75 |
0,1307 |
6,535 |
3,266 |
1,80 |
0,1353 |
6,765 |
3,382 |
1,85 |
0,1400 |
7,000 |
3,500 |
47
|
|
|
Закінч. табл. 5.1 |
|
1 |
2 |
3 |
|
4 |
1,90 |
0,1453 |
7,265 |
|
3,632 |
2,00 |
0,1500 |
7,500 |
|
3,750 |
2,05 |
0,1556 |
7,780 |
|
3,890 |
2,10 |
0,1603 |
8,015 |
|
4,008 |
2,15 |
0,1653 |
8,265 |
|
4,132 |
2,20 |
0,1707 |
8,035 |
|
4,268 |
2,25 |
0,1817 |
9,085 |
|
4,542 |
2,30 |
0,1873 |
9,365 |
|
4,632 |
2,35 |
0,1933 |
9,665 |
|
4,832 |
2,40 |
0,1993 |
9,965 |
|
4,982 |
2,45 |
0,2053 |
10,265 |
|
5,182 |
2,50 |
0,2113 |
10,565 |
|
5,232 |
|
|
|
|
|
Аналізують одержані результати, складають висновки і рекомендації.
5.6. Визначення активності пероксидази
Ферменти пероксидази окиснюють певні сполуки за допомогою гідроген пероксиду або органічних пероксидів. Із гідроген пероксидом пероксидази утворюють комплексну сполуку, в результаті пероксид активується і набуває здатність діяти як акцептор водню.
Пероксидази містяться в організмах тварин, рослин, молоці. Реакцією на пероксидазу визначають ефективність високотемпературної пастеризації молока.
Мета роботи: засвоїти методику визначення активності пероксидази. Завдання на виконання роботи: визначити активність пероксидази у
молоці та молокопродуктах. Апаратура: газовий пальник.
Лабораторний посуд: пробірки; піпетки.
Матеріали і реактиви: молоко і молочні продукти; розчин йодистокалієвого крохмалю (3 г крохмалю змішують із невеликою кількістю холодної води. Окремо в колбі доводять до кипіння100 мл води і при безперервному перемішуванні приливають воду до розведеного крохмалю. Одержаний розчин кип'ятять протягом 1 – 2 хв. Після охолодження до розчину додають3 г калій йодистого і перемішують. Розчин нестійкий, тому його готують у невеликій кількості і зберігають у темному, прохолодному місці); 0,5 %-ний розчин гідроген пероксиду.
Принцип методу: Пероксидаза, що міститься в молоці, каталізує реакцію окиснення КJ гідроген пероксидом:
2КJ + Н2О2 → 2КОН + J2
При взаємодії молекулярного йоду з крохмалем у молоці з’являється синє забарвлення.
Хід роботи. У пробірки наливають по5 мл молока або кисломолочних
продуктів. Додають по 5 краплин |
розчину |
йодистокалієвого |
крохмалю |
і по5 |
краплин 0,5 %-ного розчину |
гідроген |
пероксиду. Вміст |
пробірок |
після |
48