3.1. Визначення амінокислот методом тонкошарової хроматографії

газоподібні та рідкі речовини будь-якої природи і в будь-якій кількості. Найпоширенішим є хроматографічне розділення в трубках, заповнених

сорбентом (колоночна хроматографія), а також у тонкому шарі сорбенту, нанесеному на пластинку (тонкошарова хроматографія).

Мета роботи: засвоєння методу розділення амінокислот за допомогою тонкошарової хроматографії.

Завдання на виконання роботи: провести розділення суміші амінокислот

розчини амінокислот (свідки); для проявлення хроматограм – 0,5 %-й розчин нінгідрину в ацетоні оцтовокислому(0,5 г нінгідрину розчиняють у невеликій кількості ацетону у мірній колбі місткістю100 мл, далі додають 4 мл дистильованої води та 1 мл льодяної оцтової кислоти, перемішують, доводять до позначки ацетоном); для елюювання плям – 0,005 %–й розчин CuSO4·3H2O у 75 %-му етанолі (0,005 г CuSO4·3H2O розчиняють у 21 мл дистильованої води, потім у колбу наливають 75 мл 96 %-го етанолу).

Принцип методу ґрунтується на розділенні суміші амінокислот між двома фазами – рухомою та нерухомою. Нерухома фаза формується за рахунок вологи (води), яка зв’язана з сорбентом; нанесеним на пластинку, а рухома – це один або кілька органічних розчинників. Швидкість руху компонентів суміші буде залежати від співвідношення між їх розчинністю у воді. Що краща розчинність речовин у воді, то більше вони будуть затримуватися вологою у сорбенті і то повільнішим буде рух по пластинці.

Хід роботи. На хроматографічній пластинці простим олівцем проводять лінію на відстані 1,0 – 1,5 см від краю. Це лінія старту A (див. рисунок).

15

В

Б

Схема розділення суміші речовини на пластинці з тонким шаром сорбенту:

А– лінія старту; Б – центр плями; В – лінія фронту розчинника; 1, 2 – “свідки”;

Х– суміш 1 і 2.

Мікропіпеткою на лінію старту на відстані1 см один від одного наносять

має бути такою, щоб пластинка занурювалася у нього лише на0,5 см, аби не вимити нанесені проби. Пластинку розміщують у камері під невеликим кутом, спираючи її на стінку посудини. Зверху камеру накривають шліфованою кришкою або склом.

Підняття розчинника по шару сорбенту не має перевищувати10 – 11 см, інакше буде спостерігатись значне уповільнення просування розчину та дифузія плям, і як наслідок, значні коливання результатів.

Після того як розчинник досягне визначеного рівня, пластинку виймають і відмічають лінію підняття розчинника, яка називається лінією фронту.

Після розділення суміші хроматограму обробляють0,5 %-ним розчином нінгідрину і протягом2 – 3 хв підсушують у витяжній шафі. Після цього хроматограму переносять до сушильної шафи для проявлення плям. Через 5 – 7 хв за температури80 – 100 °С інтенсивність забарвлення плям буде максимальною.

Проявлені хроматограми піддають якісному аналізу: ідентифікують амінокислотний склад суміші та визначають Rf кожної амінокислоти.

Для цього позначають (див. рисунок) положення плям дослідної суміші та “свідків”. Далі вимірюють відстані від лінії старту до центра плями (АБ) та від лінії старту до лінії фронту розчинника(АВ). Відношення цих відстаней називається коефіцієнт розподілу Rf

Коефіцієнт розподілу Rf характеризує положення амінокислоти на хроматограмі, є характерною величиною для кожної амінокислоти і залежить від типу та активності сорбенту, товщини його шару, складу розчинника,

16

температури.

Метод елюювання речовин з хроматограми

Ідентифіковані амінокислоти можна визначати і кількісно.

Із пластинки шпателем або ланцетом знімають забарвлений шар сорбенту або вирізають пляму та подрібнюють. Післяїї цього сорбент із сполукою вміщують у чисті центрифужні пробірки, наливають у них по 3 мл розчинника (0,005 %–й розчин CuSO4.3H2O у 75%-у етанолі) для вимивання із сорбенту речовини. Закривають пробкою, інтенсивно струшують і ставлять у темне місце на 30 хв для елюювання сполук. Потім вміст пробірoк центрифугують, осад відкидають, а центрифугат колориметрують.

Для побудови калібрувального графіка використовують розчини"свідків", які наносять на хроматограму в кількості від 5 мкл до 20 – 25 мкл. Далі роблять так, як описано вище. Знаючи кількість речовини й відповідне їй значення екстинкції (оптичної густини А), будують калібрувальний графік у координатах А – мг амінокислоти.

Для визначення кількості досліджуваної амінокислоти треба за кривою за значенням виміряної оптичної густини А знайти відповідне їй значення амінокислоти, мг.

Визначити кількість речовини у суміші можна також . Наінакше хроматограму наносять визначену кількість, мг, "свідків" та певний об’єм, мкл, розчину дослідної суміші. Після проявлення та ідентифікування сполук плями "свідків" і речовин, що визначаємо, переносять до центрифужних пробірок. Далі роблять так, як описано вище. Отримані центрифугати "свідків" і дослідних речовин колориметрують, і далі, використовуючи метод порівняння, визначають невідомі концентрації за формулою:

численні. У деяких випадках потрібно визначити сумарну кількість усіх амінокислот у гідролізаті білків або в екстрактах з біологічного матеріалу.

Один із таких методів, що базується на визначенні азоту амінних груп, був запропонований Сьоренсеном.

Зміна вмісту амінного азоту свідчить про швидкість гідролізу білка, дію протеолітичних ферментів, швидкість перетворення білків та амінокислот у тканинах організму.

Під час гідролізу білка внаслідок розриву пептидних зв’язків у розчині відбувається збільшення вільних аміно- і карбоксильних груп. Амінокислоти у

17

Мета роботи: засвоєння принципу методу формольного титрування для

Матеріали та реактиви: 0,25 %-й розчин гліцину; 0,1 %-й спиртовий розчин фенолфталеїну; 0,1 н розчин натрій гідроксиду; формольна суміш (до 6

0,1 %-го спиртового розчину фенолфталеїну і краплинами0,1 н розчин натрій гідроксиду до почервоніння рідини. У нейтралізований таким чином гліцин доливають 2 мл формольної суміші. При цьому червоне забарвлення розчину

проводять таким чином: приміром, на титрування дослідного розчину(3 мл 0,25 %–го нейтралізованого розчину гліцину) витратили 0,98 мл 0,1 н розчину натрій гідроксиду. Знаючи, що 1 мл 0,1 н розчину натрій гідроксиду відповідає 1,4 мг азоту, обчислюємо кількість амінного азоту в дослідному розчині:

0,98×1,4 =1,37 мг =1,37 ×10-3 г,

Дослідний розчин містить 7,5·10–3 г амінокислоти (0,25 % – це 0,25 г у 100 мл, ми взяли 3 мл). Якщо в 7,5·10–3 г гліцину міститься1,37·10–3 г, то в 100 г

гліцину буде 18,2 г, або 18,2 %. Аналогічно роблять розрахунок вмісту амінного азоту у гідролізаті білка.

Аналізують одержані результати, складають висновки і рекомендації.

18