кип’ятінні.
Апаратура: водяна баня; газовий пальник. Лабораторний посуд: пробірки; піпетки; скляні палички.
Матеріали та реактиви: 1 %-й розчин яєчного білка; 1,0 %–й та 10,0 %- ний розчини оцтової кислоти; насичений розчин натрій хлориду; 10 %-й розчин
натрій гідроксиду. |
|
|
|
|
Принцип методу. |
Стійкість |
білків |
у розчині зумовлена |
наявністю |
гідратної оболонки і |
певного |
заряду |
молекули. Порушення факторів, |
що |
стабілізують структуру молекули білка, призводить до осадження білків.
При кип'ятінні більшості білків порушуються зв'язки, властиві нативному стану молекули білка – відбувається денатурація.
Кращий спосіб осадження білків– кип'ятіння у середовищах, що мають значення рН, яке дорівнює ізоелектричній точці. Внесення в розчин білка нейтральних солей (амоній сульфату, натрій хлориду) прискорює осадження під час кип'ятіння в результаті дегідратації білкових часток.
У сильнокислих і сильнолужних розчинах білок не випадає , в осад оскільки у кислому середовищі він завжди має позитивний заряд, у лужному – негативний.
Хід роботи. У п'ять пробірок наливають по 3 мл розчину яєчного білка. Нейтральний розчин білка в першій пробірці нагрівають до кипіння,
відбувається денатурація білка, утворення осаду.
До розчину білка у другій пробірці додають1 мл 1 %-го розчину оцтової кислоти та нагрівають до кипіння. Білок випадає в осад. За цих умов частинки білка втрачають заряд, тому що рН середовища близька до ізоелектричного стану.
У третю пробірку вносять1 мл 10 %-го розчину оцтової кислоти для створення кислої реакції середовища. При кип'ятінні розчину осад не утворюється, тому що молекули білка мають позитивний заряд, що підвищує їх стійкість.
Учетверту пробірку додають 1 мл 1 %-го розчину оцтової кислоти, кілька краплин насиченого розчину натрій хлориду і нагрівають. Випадає білий осад. Його утворення зумовлене тим, що білок при взаємодії з натрій хлоридом втрачає гідратну оболонку.
Уп'яту пробірку вносять1 мл 10 %-го розчину натрій гідроксиду для створення лужного середовища. При кип'ятінні рідини осад не утворюється, оскільки в лужному середовищі збільшується негативний заряд білка.
Дані заносять до таблиці:
Нейтральне |
Слабокисле |
Кисле |
Кисле |
Лужне |
середовище |
середовище |
середовище |
середовище |
середовище |
|
|
|
+ електроліт |
|
|
|
|
|
|
Аналізують одержані результати, складають висновки і рекомендації.
3.5. Кількісне визначення білка на основі біуретової реакції
Мета роботи: засвоєння методу кількісного визначення білка за допомогою біуретової реакції.
23
Завдання на виконання роботи: визначити концентрацію |
|
|
білка |
у |
|||||||||
дослідній пробі за біуретовою реакцією. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
Апаратура: фотоелектроколориметр. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
Лабораторний посуд: пробірки; піпетки. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
Матеріали та реактиви: біуретовий реактив (1,5 г купрум сульфату, 6 г |
|
||||||||||||
сегнетової солі, 300 мл 10 %-го розчину натрій гідроксиду розчиняють в1 л |
|
||||||||||||
дистильованої води); 1, 2, 3, 4, 5 %-ні розчини яєчного білка. |
|
|
|
|
|
|
|||||||
Принцип методу. Метод ґрунтується на властивості білків у лужному |
|
||||||||||||
середовищі давати з біуретовим реактивом синьо-фіолетове забарвлення. Поява |
|
||||||||||||
його зумовлена наявністю у молекулі білка пептидних зв’язків, що утворюють |
|
||||||||||||
за даних умов мідно-натрієві солеподібні комплекси. Інтенсивність забарвлення |
|
||||||||||||
залежить від кількості цих зв’язків, а отже і від кількості білка в розчині, а |
|
||||||||||||
також від кількості біуретового реактива. Тому при додаванні визначеної |
|
||||||||||||
кількості реактива, ступінь забарвленості буде прямо пропорційна концентрації |
|
||||||||||||
білка |
в |
розчи. Інтенсивність |
забарвлення |
|
визначають |
|
|||||||
фотоелектроколориметрі. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
Хід роботи. У п'ять пробірок наливають по2 мл стандартних розчинів |
|
||||||||||||
білка різної |
концентрації, наприклад 1, 2, 3, 4, |
5 |
%-ні |
розчини. У |
|
шосту |
|
||||||
пробірку наливають 2 |
мл |
дослідного |
розчину |
білка, |
в |
сьому– |
|
2 |
мл |
|
|||
дистильованої води (контроль). Потім у всі пробірки додають |
8помл |
|
|||||||||||
біуретового |
реактиву. |
Вміст пробірок |
перемішують |
і |
через30 |
хв |
на |
|
|||||
фотоелектроколориметрі |
|
визначають |
оптичну |
|
густину(екстинкцію) |
|
при |
|
|||||
червоному світлофільтрі. Як контроль використовують пробу з дистильованою |
|
||||||||||||
водою. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Результати |
перших |
п'яти |
проб |
|
використовують |
|
|
для |
побу |
||||
калібрувального графіка. На осі абсцис відкладають значення концентрації |
|
||||||||||||
стандартних |
розчинів білка, на осі ординат – відповідні їм |
значення оптичної |
|
||||||||||
густини D. Одержані точки з'єднують прямою лінією. Визначивши значення |
|
||||||||||||
оптичної густини дослідного розчину білка, з |
|
калібрувальним |
графіком |
|
|||||||||
знаходять його концентрацію. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
Аналізують одержані результати, складають висновки і рекомендації. |
|
|
|
||||||||||
|
3.6. Визначення відновленого глутатіону |
|
|
|
|
|
|
||||||
Глутатіон один із найпоширеніших природних пептидів. Він міститься |
|
||||||||||||
майже у всіх клітинах рослин, тварин, а також у бактеріях і дріжджах. Він |
|
||||||||||||
побудований із трьох амінокислот– глутамінової кислоти, цистеїну і гліцину. |
|
||||||||||||
Глутатіон |
виконує |
роль |
коферменту |
в |
|
|
деяких |
||||||
внутрішньомолекулярного перенесення водню та ізомеризації. Функціонально |
|
||||||||||||
активною |
групою |
є |
сульфгідрильна |
група |
цистеїну. Відновлена |
|
форма |
|
|||||
глутатіону (Гл – SH) легко окиснюється, наприклад, молекулярним киснем у |
|
||||||||||||
присутності металів або йодом, утворюючи окиснену форму (Гл–S–S–Гл). |
|
|
|
||||||||||
Окиснення |
може |
відбуватися |
також |
ферментативно |
|
за |
уча |
||||||
глутатіондегідрогенази, а також, дегідроаскорбінової кислоти:
24
CH2-SH |
|
|
|
CH2 |
¾ S ¾¾¾ S ¾ CH2 |
|
|
||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
NH - CH - CO |
|
NH - CH - CO |
NH - CH - CO |
||||||||||||
|
|
|
|
|
– 2H+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
CO |
NH |
CO |
NH |
CO |
NH |
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
CH2 |
CH2 |
+ 2H+ |
CH2 |
CH2 |
CH2 |
CH2 |
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
CH2 |
COOH |
|
CH2 |
COOH |
CH2 |
COOH |
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
CH-NH2 |
|
|
|
CH-NH2 |
CH-NH2 |
|
|
||||||||
|
|
COOH |
|
|
|
|
|
COOH |
|
|
COOH |
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||
відновлена форма Гл – SH |
|
окиснена форма Гл – S – S – Гл |
|
|
|||||||||||
Глутатіон бере участь у багатьох фізіологічних процесах в організмі, він відіграє значну роль в оборотних перетвореннях дисульфідних груп білків у сульфгідрильні. Зокрема, відновлена форма глутатіону підвищує активність тіолових ферментів, які містять в активному центрі сульфгідрильну групу. До тіолових ферментів належить протеолітичний фермент рослинного походження папаїн. Папаїн міститься у борошні, і підвищення його активності призводить до розпаду білків борошна і дріжджів, що знижує якість харчових продуктів.
Для запобігання руйнування клейковини під впливом папаїну відновлений глутатіон окиснюють, наприклад (KBrO3) або дегідроаскорбіновою кислотою.
Мета роботи: засвоєння методу визначення відновленого глутатіону.
Завдання на виконання роботи: кількісно визначити |
відновлений |
|
глутатіон у борошні чи дріжджах. |
|
|
Апаратура: лабораторна центрифуга; шуттель-апарат; годинник. |
|
|
Лабораторний посуд: мірні колби |
місткістю100 мл; мірні |
циліндри |
місткістю 100 мл; піпетки місткістю 5 мл, |
конічні колби місткістю100 мл; |
|
скляні палички; центрифужні пробірки; бюретки для титрування.
Матеріали та реактиви: 1 М розчин сульфосаліцилової кислоти; 4 %-й розчин сульфосаліцилової кислоти; 0,001 н розчин KJO3; 5 %–й розчин KJ; 1 н розчин натрій гідроксид; 1 %–й розчин крохмалю; 5 %-й розчин кадмій сульфату; борошно; дріжджі.
Принцип методу ґрунтується на окисненні відновленого глутатіону йодом у кислому середовищі:
|
OH |
|
OH |
|
||||||||
KJO3 + 5KJ + 3 |
|
|
|
|
COOH |
¾® 3 |
|
|
|
|
COOК |
+ 3H2O + 3J2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
SO3H |
|
SO3K |
|
||||||||
2 Гл-SH + J2 = Гл-S-S-Гл + 2HJ
25
Хід роботи. У мірну колбу |
місткістю100 мл вносять 10 г |
дослідного |
|
||||||||||||||
матеріалу. Поступово, перемішуючи, доливають 80 мл |
дистильованої |
води. |
|
||||||||||||||
Колбу з сумішшю поміщають на шуттель–апарат на10 хв. Потім, повільно |
|
||||||||||||||||
перемішуючи, додають |
5 |
мл |
1 |
М |
розчину |
|
сульфосаліцилової |
кислоти, |
|
||||||||
залишають |
на 30 |
хв, після |
цього доводять |
водою |
до |
позначки |
і знову |
||||||||||
інтенсивно |
перемішують. |
Суміш |
переносять |
|
у |
центрифужні |
пробірки |
і |
|||||||||
центрифугують. У центрифугаті визначають загальну кількістьSH–груп, |
|
||||||||||||||||
перераховуючи на відновлений глутатіон. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||
У |
конічну |
колбу |
|
місткістю100 – 150 мл |
піпеткою |
вносять25 |
мл |
|
|||||||||
центрифугату (що відповідає 2,5 г наважки), додають 25 мл дистильованої води |
|
||||||||||||||||
і, перемішуючи, вносять по 2,5 мл 4 %–го розчину сульфосаліцилової кислоти і |
|
||||||||||||||||
5 %–го розчину KJ. Додають 10 краплин 1 %–го розчину крохмалю і титрують |
|
||||||||||||||||
0,001 н розчином KJO3 до появи синього забарвлення. Для контролю чистоти |
|
||||||||||||||||
реактивів в аналогічних умовах титрують 50 мл дистильованої води. |
|
|
|
|
|||||||||||||
Розрахунок кількості сульфгідрильних сполук, мг %, у перерахунку на |
|
||||||||||||||||
відновлений глутатіон здійснюють за формулою: |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||
|
|
|
|
|
А = (а - б )×12,28, |
|
|
|
|
|
(3.2) |
|
|
||||
де a і б – об’єми 0,001 н |
розчину KJO3, що пішов |
на |
титрування, відповідно |
|
|||||||||||||
проби і контролю, мл; |
12,28 |
– |
коефіцієнт |
перерахунку |
на |
відновлений |
|
||||||||||
глутатіон. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Для |
|
визначення |
кількості |
відновленого |
|
глутатіону |
піпеткою |
Мора |
|||||||||
відбирають 50 мл центрифугату (5 г наважки) у мірну колбу місткістю 100 мл. |
|
||||||||||||||||
Додають 40 мл 5 %-го розчину кадмій |
сульфату |
4і мл 1 н |
розчину |
натрій |
|
||||||||||||
гідроксиду. Суміш ретельно перемішують, доводять дистильованою водою до |
|
||||||||||||||||
позначки і залишають на 30 хв. Потім суміш центрифугують, |
|
|
|
|
|
||||||||||||
У конічну колбу місткістю 100 – 150 мл вносять 50 мл центрифугату (2,5 г |
|
||||||||||||||||
наважки) і визначають кількість SH–сполук, що залишилися в розчині, мг %, за |
|
||||||||||||||||
допомогою описаної вище методики: |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||
|
|
|
|
В = (а1 - б1 )×12,28, |
|
|
|
|
|
(3.3) |
|
|
|
||||
де а1, б1 |
– об'єми 0,001 н розчину KJO3, що пішов на |
титрування, відповідно |
|
||||||||||||||
проби і контролю, мл. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
Кількість відновленого глутатіону в наважці визначають за різницею між |
|
||||||||||||||||
загальною кількістю сульфгідрильних сполук і кількістю, що залишилась після |
|
||||||||||||||||
осадження відновленого глутатіону кадмій сульфатом: |
|
|
|
(3.4) |
|
|
|
||||||||||
|
|
|
|
|
V = A - B. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
Аналізують одержані результати, складають висновки і рекомендації. |
|
|
|||||||||||||||
3.7.Розділення білків та вивчення їх властивостей
Укоров’ячому молоці в середньому міститься приблизно3,2 % білкових речовин. Основним білком молока є казеїн, на який припадає 78 – 85 % усіх білків молока. Казеїн – це гетерогенний білок, який осідає із знежиреного молока при рН 4,6.
Основні білки молочної сироватки– β-лактоглобулін, α-лактоальбумін, імуноглобулін, протеозо-пептони – за вмістом незамінних амінокислот є найбільш біологічно цінною частиною молока.
Мета роботи: засвоєння методу розділення білків молока.
26