Определение белковых фракций в сыворотке крови методом электрофореза на бумаге, по а.Е.Гурвичу

Находящиеся в сыворотке белки при помощи электрофореза можно разделить на ряд фракций: альбуминовая фракция, ₁-, ₂, -; -фракции глобулинов и некоторые другие.

Диагностическое значение имеет определение не только общего содержания белка, но и соотношения между отдельными его фракциями в сыворотке крови, поскольку выяснение этих соотношений позволяет выявить ряд заболеваний, при которых общее содержание белка в крови не изменяется.

Одним из распространенных в клинических лабораториях методов определения белковых фракций в сыворотке крови является метод электрофореза на бумаге.

Электрофорезом называется движение частиц, имеющих определенный электрический заряд, во внешнем электрическом поле к полюсу с противоположным зарядом.

Принцип. Диссоциация содержащихся в молекуле белка основных и кислых групп обусловливает появление заряженных белковых частиц (ионов) в растворе. Величина и знак заряда зависят главным образом от соотношения кислых и основных групп в белке, рН и ионной силы окружающей среды.

Если сыворотку крови поместить на смоченную буферным раствором полосу бумаги, через которую пропустить постоянный электрический ток, то частицы находящихся в ней белков начнут перемещаться к полюсу с противоположным зарядом. Скорость перемещения белковых частиц пропорциональна величине их свободного заряда и градиенту потенциала электрического поля.

При помощи электрофореза на бумаге белки сыворотки крови можно разделить на 5-9 фракций и определить их относительное содержание. Для этого бумажные полосы после электрофореза, проведенного в специальном приборе, обрабатывают красками, специфически соединяющимися с белками. Затем краску элюируют и определяют ее концентрацию в элюате колориметрически.

Схематическое изображение камеры для электрофореза прибора ЭФА-1 приведено ниже.

Ход определения. Используя специальные винты, камеру устанавливают горизонтально. Затем открывают крышку камеры и вынимают рамку для натягивания бумажных полос. Заполняют электродные кюветы буферным раствором (рН=8,6), установив в них одинаковый уровень жидкости, и оба отделения каждой кюветы соединяют фильтровальной бумагой.

Полосы хроматографической бумаги размером 4 х44 см помещают в рамку так, чтобы они были натянуты. простым карандашом отмечают место (12см от катодного конца), на которое впоследствии поперечной полосой (не пятном) пипеткой, покровным стеклом или специальной рамкой наносится сыворотка. Рамку опускают в камеру и, дав бумажным полосам пропитаться буфером, наносят 0,01мл сыворотки на отмеченный карандашом участок бумаги (стартовая линия). После этого крышку камеры закрывают и включают постоянный электрический ток. Дают напряжение 150-170вольт. Через 16-18 часов бумажные полосы извлекают из прибора, концы полос, погруженные в буферный раствор, обрезают или избыток влаги на них удаляют фильтровальной бумагой. Полосы высушивают в сушильном шкафу при 105⁰ в течение 20 минут.

Ход определения. Перед началом работы проверяют правильность установки прибора на нуль (юстировку) при помощи специальных призм или по дистиллированной воде, коэффициент преломления которой равен 1,333. Для этого на поверхность измерительной призмы наносят несколько капель воды и осторожно закрывают головку. Осветительным зеркалом 9 пучок света направляют через осветительную призму так, чтобы он равномерно осветил поле зрения. Маховичком устанавливают индекс отсчета (неподвижный горизонтальный штрих сетки) на 1,333, винтом компенсатора 8 устраняют окрашенность границы светотени. При правильной настройке прибора граница раздела светлого и темного полей должна совпадать с визирным перекрестием.

Проверив настройку прибора, тщательно вытирают воду на призме. Для определения общего белка сыворотки крови 1-2 капли ее наносят на измерительную призму и, глядя в окуляр, вращением маховичка совмещают границу темного и светлого полей с перекрестием нитей. Затем по шкале показателей преломления снимают отсчет. По шкале делают отсчет целых, десятых, сотых и тысячных долей показателя преломления; десятитысячные доли оцениваются на глаз.

Расчет. Определив показатель преломления исследуемой сыворотки, по таблице Рейса находят соответствующее процентное содержание белка.