Методы изучения ферментативной активности бактерий.

Состав ферментов бактерий определяется геномом и поэтому характерен для тех или иных видов, т.е. является видовым признаком. Поэтому изучение ферментативных или биохимических свойств очень важно для дифференциации (отличия) и идентификации (определения вида) бактерий. Наиболее часто определяют ферменты класса гидролаз и оксидоредуктаз.

Среди ферментов оксидоредуктаз для идентификации микроорганизмов используют такие ферменты, как каталаза и цитохромоксидаза (ЦО).

Каталаза – фермент, расщепляющий Н₂О₂ с образованием водорода и кислорода. Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться после смешивания микробных клеток с 1 % р-ром Н₂О₂.

Цитохромоксидазу обнаруживают так: смачивают реактивом бумажку и наносят суточную культуру микроорганизмов. Получается синее окрашивание.

Среди ферментов гидролаз изучаются ферменты, расщепляющие углеводы (или сахара) и ферменты, расщепляющие белки (или протеины). Способность бактерий расщеплять углеводы называется сахаролитическими свойствами, а способность расщеплять белки - протеолитическими свойствами.

Эти свойства выявляются по конечным продуктам расщепления после посева на определенные среды.. При распаде сахаров определяют образование кислот (молочной, уксусной, муравьиной) и газов (СО₂ или Н₂ ), а при распаде белков - образование щелочей, H₂S, NH₃.

Совокупность сахаролитических, протеолитических и других ферментативных свойств бактерий называется биохимическими свойствами бактерий.

Изучение сахаролитических свойств.

Для определения сахаролитических свойств используются среды: плотные среды Эндо, Левина и Плоскирева, а также жидкие и полужидкие среды Гисса.

Среды Эндо, Левина, Плоскирева содержат лактозу и определенный индикатор.

Эти среды позволяют отличить патогенные бактерии от кишечной палочки - E. coli. E. coli способна расщеплять лактозу, т.к. имеет фермент галактозидазу. При расщеплении лактозы образуются кислые продукты, которые изменяют цвет индикатора. Поэтому E. coli образует на средах окрашенные колонии: на среде Эндо - красные колонии с металлическим блеском; на среде Левина – темно-синие колонии; на среде Плоскирева – красные колонии. Сальмонеллы и шигеллы не имеют фермента галактозидазу, они не расщепляют лактозу, и цвет среды не изменяется. Поэтому сальмонеллы и шигеллы образуют на средах Эндо, Левина и Плоскирева бесцветные колонии.

Таким образом, на одной и той же среде наблюдается различный характер роста разных видов бактерий, т.к. они имеют различные ферменты. Это позволяет отличить один вид от другого.

Среды Гисса содержат лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу и маннит и различные индикаторы. Если бактерии расщепляют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды, а если до кислоты и газа – наблюдают появление газообразных продуктов.

Жидкие среды Гисса состоят из пептонной воды, 1 % углевода и индикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). В среду опускается поплавок, который при стерилизации заполняется средой. Исходный цвет среды – соломенно-желтый. При расщеплении углевода цвет среды становится ярко-розовым (красным). Если образуется газ, он накапливается в поплавке. Если углевод не расщепляется, цвет среды не изменяется.

Полужидкие среды Гисса состоят из 0,2-0,5 % мясо-пептонного агара (МПА), 1 % углевода и индикатора ВР (водно-голубая краска и розоловая кислота). Исходный цвет среды - розовато-серый. При расщеплении углевода цвет среды становится голубым, а если образуется газ, наблюдаются разрывы в среде.

Определенный вид бактерий ферментирует не все, а только некоторые углеводы, поэтому в одних пробирках цвет изменяется, а в других – не изменяется, и получается "пестрый ряд". Каждый вид бактерий характеризуется своим "пестрым рядом".

Изучение протеолитических свойств.

Протеолитические свойства бактерий изучают: а) по способности разжижать желатин: разные виды бактерий имеют разную форму разжижения желатина; S. aureus – в виде воронки; Bac. antracis – в виде опрокинутой елки; Vibrio cholerae – в виде гвоздя и т.д. Разжижают желатин бактерии, имеющие фермент - коллагеназа;б) по конечным продуктам распада белков после посева на мясо-пептонный бульон (МПБ). Могут быть следующие конечные продукты: индол, Н₂S, NH₃.

Для обнаружения этих продуктов используют бумажки с индикаторами. Индикатор для индола - щавелевая кислота (бумажка окрашивается в розовый цвет). Для Н₂S – ацетат свинца (черный цвет). Для NH₃ – лакмусовая бумажка (синий цвет).

Дополнительно изучаются такие свойства, как восстановление нитратов в нитриты, бутандиоловое брожения на среде Кларка, расщепление крахмала и др.

10. Основные принципы культивирования бактерий. Требования, предъявляемые к питатальным средам. Классификация питательных сред по назначению, их примеры. Состав и назначение МПА, МПБ, кровяного агара, сред Эндо, Левина и Плоскирева.

Для культивирования необходимо: 1) соответствующая среда; 2) правильно произведенный посев; 3) оптимальные условия: температура, влажность, аэрация (снабжение О₂) или создание бескислородных условий для анаэробов;4)определенной время для выращивания (чаще – 24 час).

Требования к питательным средам.

а) среды должны быть питательными - содержать все необходимые для жизнедеятельности вещества;б) иметь определенное значение рН; для большинства патогенных микробов оптимальным является рН 7,2-7,4; в) обладать буферностью – содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена микроорганизмов, для того чтобы не изменялось значение рН среды;г) быть изотоничными - осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки; д) быть стерильными для получения чистой культуры;е) содержать достаточное количество Н₂О, т.к. бактерии питаются по законам осмоса и диффузии;

ж) обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, для аэробов rH₂ – не ниже 10; для анаэробов – не выше 5;з) быть прозрачными;

Классификация питательных сред.По консистенции среды делят на: а) жидкие: пептонная вода (ПВ), мясопептонный бульон (МПБ); б) полужидкие: полужидкий мясопептонный агар (МПА) и др.; в) плотные или твердые: МПА, мясопептонный желатин, свернутая сыворотка; г) сыпучие: разваренное пшено, кварцевый песок; д) сухие – гигроскопические порошки, выпускаемые промышленностью; Для уплотнения сред используют агар, желатин или селикагель. Агар – полисахарид, выделенный из морских водорослей. Он образует в воде гели, которые плавятся при температуре 100 С и застывают при 45 С. К полужидким средам агар добавляют в количестве 0,5% (0,3-0,7%), к плотным – 1,5-2%.

По составу среды делят на:а) естественные – натуральные продукты (яйца, овощи), животные ткани, желчь, сыворотка крови;б) искусственные – среды, приготовленные из различных настоев или отваров с добавлением неорганических солей, углеводов, азотистых веществ;

в) синтетические – среды, приготовленные из определенных химических соединений в точно указанных концентрациях.

По назначению среды делят на:

а) основные (простые) – используют для культивирования многих видов микроорганизмов: ПВ, МПБ, МПА; на простых средах хорошо растут прототрофные бактерии; простые среды служат основой для приготовления ряда сложных питательных сред;

б) специальные (сложные) - используют для тех микроорганизмов, которые не растут на простых средах: сахарный МПБ, сахарный МПА, сывороточный МПБ и МПА, кровяной МПА, асцитический МПБ;в) элективные (избирательные) – используют для определенных видов; создаются оптимальные условия для этих видов, а другие виды не растут или растут плохо: щелочная ПВ (для холерного вибриона), среда Сабуро (для грибов), желточно-солевой агар (для стафилококка), сывороточные среды – среда Ру и среда Леффлера (для дифтерийных коринебактерий), среда Китта-Тароцци (для анаэробов), среды с желчью (для тифо-паратифозных бактерий), среды с глицерином (для микобактерий туберкулеза); г) дифференциально-диагностические среды используют для изучения биохимических свойств и дифференцировки (отличия) одного вида микроорганизмов от другого по его ферментативным свойствам: среды Эндо, Левина, Плоскирева, среды Гисса. Состав сред подбирается так, чтобы выявить характерные отличия ферментативных свойств одного вида от другого.

Среда Эндо состоит из МПА, 1 % лактозы, фуксина и сульфита натрия, который его обесцвечивает, исходная среда имеет светло-розовый цвет.

Среда Левина состоит из МПА, лактозы, эозина, метиленовой сини и фосфорнокислого натрия, исходная среда имеет красно-фиолетовый цвет.

Среда Плоскирева состоит из МПА, лактозы, бриллиантового зеленого, йода, нейтрального красного, солей желчных кислот, минеральных солей. Эта среда также является элективной, т.к. подавляет рост многих микробов (кишечной палочки и др.) и способствует лучшему росту некоторых болезнетворных бактерий (возбудителей брюшного тифа, паратифов).

Эти среды используются для идентификации бактерий семейства Enterobacteriaceae. Они позволя ют отличить патогенные микроорганизмы от кишечной палочки.

1. Мясо-пептонный агар К 1л мясной воды прибавляют 1г пептона и 0,5г хлорида натрия, кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения добавленных ингредиентов. Приготовленный таким образом бульон фильтруют, устанавливают слабощелочную реакцию (рН 7,2-7,4) и добавляют 0,2-2г измельченного агар-агара (в зависимости от качества агар-агара и назначения среды). После добавления агар-агара жидкость кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения агара. При помутнении среды ее просветляют. Приготовленный агар фильтруют или декантируют, разливают в пробирки или во флаконы и стерилизуют в автоклаве при температуре +120⁰С в течение 20 минут.

2. Сахарный бульон (бульон с глюкозой) К 1л мясопептонного бульона нейтральной реакции прибавляют глюкозу в количестве 0,25мг-2г. Перед добавлением к бульону глюкозу растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Приготовленную среду стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 минут или однократно в автоклаве при температуре +115⁰С 30 минут.

3. Кровяной агар - специальная бактериол. среда, служащая для выделения бактерий (напр., стрептококков) и установления их гемолитической активности. Для приготовления К. а. к расплавленному и охлажденному до 45°С (не выше) 2% МП А добавляют 5-10% подогретой стерильной дефибринированной крови барана, кролика, лошади, человека, смешивают и разливают по чашкам Петри, выдерживают сутки в термостате на возможную бактер. контаминацию. К-ру засевают штрихом или бляшкой.

11. Методы выделения чистых культур аэробных бактерий. Основные этапы выделения чистой культуры. Работа 1-го, 2-го и 3-го дня по выделению чистой культуры. Методы изучения сахаролитических свойств бактерий. Состав и назначение сред Гисса.

Чистая культура микроорганизмов – это популяция клеток (видимый рост) одного вида, выросшая на стерильной питательной среде.

Выделение чистой культуры – бактериологический метод. Этот метод является основным методом диагностики бактериальных инфекций.

Для получения чистой культуры необходимо отделить бактериальные клетки разных видов друг от друга. Чаще всего используются механические способы отделения клеток– специальные методы посева: а) посев шпателем по Дригальскому в три чашки Петри; на третьей чашке вырастают отдельные колонии; каждая колония – один вид, т.к. колония – потомство одной клетки;б) посев петлей "штрихами" или "сеткой": делают посев прерывистыми штрихами; в том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост будет в виде сплошного штриха, а на штрихах с небольшим количеством клеток вырастут отдельные колонии;

Таким образом, при помощи специальных методов посева получают изолированные колонии разных видов бактерий.

Выделение чистой культуры проводят в три этапа:

Первый этап (1-ый день): а) из материала (смесь бактерий разных видов) готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют; б) делают посев материала (смеси бактерий) на чашку Петри с МПА штриховым методом или по методу Дригальского и ставят в термостат при 37С на 24-48 часов.

Второй этап (2-ой день): а) наблюдают посевы и проводят описание колоний разных видов (размер, форма, цвет, поверхность, форма края, структура, консистенция); б) из колоний готовят мазки и окрашивают по Граму (колония должна содержать один вид бактерий); в) делают пересев разных колоний в разные пробирки со скошенным МПА для накопления чистой культуры; выращивают в термостате при 37С 24 часа.

Третий этап (3-ий день): проделывают работу по идентификации (определение вида) культуры и проверяют чистоту культуры. Для определения вида изучают морфологические, культуральные, тинкториальные и биохимические свойства:а) отмечают характер роста выделенной чистой культуры на МПА (визуально она характеризуется однородным ростом);

б) готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют; если культура чистая, то обнаруживают одинаковые морфологические и тинкториальные клетки; в) делают посев на среды Гисса и МПБ для изучения сахаролитических и протеолитических свойств чистой культуры; оставляют в термостате при 37 С на 24 часа.

По совокупности морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств делают вывод о видовой принадлежности выделенной чистой культуры бактерий. При необходимости изучают и другие признаки (факторы вирулентности, антигенную структуру, чувствительность к фагам и др.).

В бактериологической практике установление вида возбудителя позволяет поставить диагноз заболевания, поэтому выделение и идентификация чистой культуры - это и естьбактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний. Постановка этого метода обязательно включает и определение чувствительности выделенной чистой культуры возбудителя к антибиотикам (определение антибиотикограммы).

Изучение сахаролитических свойств.

Для определения сахаролитических свойств используются среды: плотные среды Эндо, Левина и Плоскирева, а также жидкие и полужидкие среды Гисса.

Среды Эндо, Левина, Плоскирева содержат лактозу и определенный индикатор.

Эти среды позволяют отличить патогенные бактерии от кишечной палочки - E. coli. E. coli способна расщеплять лактозу, т.к. имеет фермент галактозидазу. При расщеплении лактозы образуются кислые продукты, которые изменяют цвет индикатора. Поэтому E. coli образует на средах окрашенные колонии: на среде Эндо - красные колонии с металлическим блеском; на среде Левина – темно-синие колонии; на среде Плоскирева – красные колонии. Сальмонеллы и шигеллы не имеют фермента галактозидазу, они не расщепляют лактозу, и цвет среды не изменяется. Поэтому сальмонеллы и шигеллы образуют на средах Эндо, Левина и Плоскирева бесцветные колонии.

Таким образом, на одной и той же среде наблюдается различный характер роста разных видов бактерий, т.к. они имеют различные ферменты. Это позволяет отличить один вид от другого.

Среды Гисса содержат лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу и маннит и различные индикаторы. Если бактерии расщепляют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды, а если до кислоты и газа – наблюдают появление газообразных продуктов.

Жидкие среды Гисса состоят из пептонной воды, 1 % углевода и индикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). В среду опускается поплавок, который при стерилизации заполняется средой. Исходный цвет среды – соломенно-желтый. При расщеплении углевода цвет среды становится ярко-розовым (красным). Если образуется газ, он накапливается в поплавке. Если углевод не расщепляется, цвет среды не изменяется.

Полужидкие среды Гисса состоят из 0,2-0,5 % мясо-пептонного агара (МПА), 1 % углевода и индикатора ВР (водно-голубая краска и розоловая кислота). Исходный цвет среды - розовато-серый. При расщеплении углевода цвет среды становится голубым, а если образуется газ, наблюдаются разрывы в среде.

12. Рост и размножение бактерий. Фазы роста в жидкой питательной среде. Характер роста на жидких и плотных питательных средах. Методы изучения протеолитических свойств бактерий.

Размножение – увеличение числа особей. Способы размножения бактерий: а) деление клетки на 2 части (бинарное деление); б) почкование; в) распад нитевидных клеток; г) при помощи спор (актиномицеты).

Рост – увеличение массы в результате синтеза клеточного материала. Во время роста бактерии потребляют питательные вещества, и если объем питательной среды не изменяется, то наблюдается ее истощение и прекращение роста. Культивирование (выращивание) бактерий в такой среде называют периодическим, а культуру – периодической. Если при культивировании непрерывно подается свежая питательная среда, то такое культивирование называется непрерывным, а культура – непрерывной.

Рост периодической культуры на жидкой питательной среде разделяют на несколько фаз:.

I фаза – лаг-фаза – период между посевом и началом размножения;

II фаза – фаза логарифмического роста – период интенсивного деления бактерий и рост количества клеток;

III фаза – фаза стационарного роста – количество клеток не меняется и равно максимальной концентрации (М-концентрация);

IV фаза – фаза гибели - снижение количества живых клеток;

V фаза – фаза уменьшения скорости отмирания клеток – клетки переходят в состояние покоя.

На жидких питательных средах рост бактерий может быть: а) поверхностным – образование пленки; б) диффузным – равномерное помутнение среды; в) придонным – образование осадка.

На плотной питательной среде бактерии образуют колонии. Колониия– это макроскопическое скопление микробов одного вида, образовавшееся из одной клетки. Колонии бывают разными по размеру, форме, цвету, поверхности, форме края, консистенции, структуре.

Изучение протеолитических свойств.

Протеолитические свойства бактерий изучают:

а) по способности разжижать желатин: разные виды бактерий имеют разную форму разжижения желатина; S. aureus – в виде воронки; Bac. antracis – в виде опрокинутой елки; Vibrio cholerae – в виде гвоздя и т.д. Разжижают желатин бактерии, имеющие фермент - коллагеназа;

б) по конечным продуктам распада белков после посева на мясо-пептонный бульон (МПБ). Могут быть следующие конечные продукты: индол, Н₂S, NH₃.

Для обнаружения этих продуктов используют бумажки с индикаторами. Индикатор для индола - щавелевая кислота (бумажка окрашивается в розовый цвет). Для Н₂S – ацетат свинца (черный цвет). Для NH₃ – лакмусовая бумажка (синий цвет).

Дополнительно изучаются такие свойства, как восстановление нитратов в нитриты, бутандиоловое брожения на среде Кларка, расщепление крахмала и др.

13. Методы культивирования анаэробных бактерий (методы создания анаэробных условий ). Принципы выделения чистых культур анаэробных бактерий ( методы Вейнберга и Цейсслера ).

Методы создания бескислородных условий для культивирование анаэробов.

Для создания бескислородных условий используются физические, химические и биологические методы.

Физические методы:

1) посев в глубину плотных питательных сред (кровяной или сахарный агар): а)посев уколом в высокий столбик агара (анаэробы вырастают в глубине посева); б) посев в трубках Виньяля-Вейона; 2) выращивание на специальных средах: на среде Китта-Тароцци (жидкая питательная среда - 0,5 % глюкоза, кусочки животных тканей, например, печени, которая связывает кислород). Перед посевом среду кипятят и быстро охлаждают. После посева заливают слоем стерильного вазелинового масла. 3) выращивание в анаэростатах – специальный сосуд, из которого удален кислород.

Анаэростат – толстостенный металлический цилиндр с хорошо притертой крышкой с резиновой прокладкой. В него ставят чашки Петри (крышкой вверх) с посевами и удаляют воздух или вытесняют инертным газом.

Химические методы - поглощение кислорода воздуха в герметически закрытом сосуде (аппарате Аристовского) химическими веществами (такими как щелочной пирогаллол или гидросульфит натрия).

Биологические методы (метод Фортнера) - совместное выращивание анаэробов и аэробов. После посева чашки Петри герметически закрывают пластилином или парафином. Вначале в чашке Петри размножаются аэробы, а когда весь кислород используется, начинают расти анаэробы.

Выделение чистой культуры анаэробных бактерий также осуществляется в три этапа. При этом также получают чистую культуру из одной клетки и добиваются роста микроорганизмов в виде изолированных колоний с последующим ее пересевом и идентификацией.

Особенностью работы по выделению чистой культуры анаэробов является применение различных методов создания бескислородных условий (см. выше).

Три этапа:Первый день. Делают посев (земля, гной) на среду Китта-Тароцци.Второй день: для получения колоний делают пересев со среды Китта-Тароцци по методу Цейсслера, методу Вейнберга и методу Перетца.Третий день: колонии пересевают в пробирку с новой средой Китта-Тароцци для накопления чистой культуры; проводят идентификацию чистой культуры анаэробов по морфологическим, культуральным, тинкториальным, биохимическим и антигенным свойствам.

Посев по методу Цейсслера. Каплю (петлю) материала со среды Китта-Тароцци последовательно засевают в три чашки Петри с кровяным агаром. Посевы ставят в анаэростат или аппарат Аристовского, которые ставят в термостат. На следующий день на третьей чашке вырастают отдельные колонии. Делают пересев этих колоний на среду Китта-Тароцци для накопления чистой культуры, изучения ее свойств и точного определения вида микроорганизмов.

Посев по методу Вейнберга. Пастеровской пипеткой переносят материал со среды Китта-Тароцци последовательно в 3-5 узких пробирок с сахарным МПА, погружая пипетку в расплавленный агар до самого дна пробирки. Пробирки быстро охлаждают под холодной водой. Агар застывает и разобщает микробные клетки в глубине агара. Из этих клеток вырастают колонии, которые пересевают в новую среду Китта-Тароцци, накапливают чистую культуру и идентифицируют.

14. Особенности и способы культивирования риккетсий, хламидий и вирусов. Достоинства и недостатки методов культивирования вирусов. Методы индикации вирусов в клеточных культурах. Особенности культивирования риккетсий и хламидий.

Риккетсии и хламидии – бактерии, которые, как и вирусы, являются облигатными внутриклеточными паразитами. Поэтому для их культивирования применяются: а) тканевые культуры (описаны выше); б) куриные эмбрионы; в) лабораторные животные.

Культивирование риккетсий проводят на переживающих тканях в жидкой среде Мейтлендов (раствор Тироде и сыворотка) при 37 С 10-14 дней или на Тироде-сывороточном агаре с добавлением на поверхность измельченной эпителиальной ткани при 37 С 6-10 дней.

Широко используется культивирование в 8-12-дневном курином эмбрионе. Эмбрион заражают в полость желточного мешка или на хорион-аллантоисную оболочку. Зараженные яйца помещают в термостат при 37 С на 6-7 дней. Этот метод используется при изготовлении вакцин и диагностических препаратов из риккетсий.

Риккетсии культивируют в организме белых мышей, которых заражают интраназально. В легких мышей накапливается большое количество риккетсий.Риккетсии выращивают по методу Вейгля и Мосинга. Для этого платяных вшей заражают взвесью риккетсий путем введения в кишку через анальное отверстие с помощью специальных капилляров. Пшеничнов и Райхер разработали метод культивирования риккетсий на личинках вшей, которых кормят дефибринированной кровью с риккетсиями через мембрану кожи трупа.

Культивирование вирусов.

Вирусы – облигатные внутриклеточные паразиты. Они размножаются в живых клетках и не растут на искусственных питательных средах, поэтому методы культивирования вирусов отличаются от методов культивирования бактерий.

Методы культивирования.1. На лабораторных животных. Заражают животных (подкожно, внутримышечно, внутрибрюшино), которые чувствительны к определенным вирусам: хорьков - вирусом гриппа, кроликов - вирусом бешенства, обезьян - вирусом полиомиелита. Индикация (обнаружение) вируса проводится по признакам заболевания. Недостаток метода - не все вирусы можно культивировать на животных, например, животные невосприимчивы к вирусам человека.

2. В куриных эмбрионах. Заражают куриный эмбрион (аллонтоисная полость, хорион-аллонтоисная оболочка, амниотическая полость, желточный мешок, сам эмбрион). Куриный эмбрион – очень удобен. Он защищен от попадания других микробов (стерильный), техника работы с ним проста, можно накопить большое количество вирусов. Индикация: а) по специфическим поражениям на хорион-аллантоисной оболочке, по гибели эмбриона, б) по реакции склеивания эритроцитов – реакции гемагглютинации (РГА). Недостатки метода: а)не все вирусы (вирус полиомиелита, вирус ящура) можно вырастить в куриных эмбрионах; б) невозможно обнаружить микроб без вскрытия эмбриона; в) в нем много загрязняющих белков и других соединений. 3. В тканевых культурах. Тканевые культуры или клеточные культуры – клетки, выращенные вне организма на искусственных питательных средах. Для их приготовления используют чаще всего эмбриональные и опухолевые ткани. Метод тканевых культур разработан Дж. Эндерсом в 50-е годы. Большинство вирусов способно размножаться в культурах клеток. Для каждого вируса можно подобрать наиболее чувствительную культуру клеток.

Способы обнаружения (индикации) вирусов в тканевой культуре.

Вирусы можно обнаружить следующим образом.

1. По цитопатическому действию (ЦПД). В результате размножения вирусов в клетках происходят морфологические изменения клеток (вакуолизация цитоплазмы, деструкция митохондрий, округление клеток). Часть клеток погибает и отслаивается от стекла. Вместо сплошного монослоя остаются отдельные клеточные островки. ЦПД обнаруживают под микроскопом (8). По ЦПД можно не только обнаружить, но и идентифицировать вирусы. Например, вирус полиомиелита вызывает мелкозернистую деструкцию клеток; аденовирусы вызывают образование скоплений клеток в виде виноградных гроздьев; вирус кори вызывает образование симпластов – многоядерных клеток.2. По образованию включений. Включения - скопления вирусов в клетках. Они имеют различную форму и размеры. Их окрашивают по Романовскому-Гимзе или флюорохромами и наблюдают под микроскопом.

3. По гемадсорбции. Клетки, зараженные вирусами, могут адсорбировать эритроциты. Вирусы выходят на поверхность клеток и связывают эритроциты. Эритроциты добавляют к культуре и через некоторое время промывают физиологическим раствором. На поверхности клеток под микроскопом видны прилипшие эритроциты в виде разнообразных фигур;.

4. По реакция гемагглютинации. Гемагглютинация - склеивание эритроцитов под влиянием вирусов. Эритроциты добавляют к культуральной жидкости. Если в ней есть вирусы, то эритроциты склеиваются.5. По "цветной" реакции. Клетки культуры выращиваются на жидкой среде с индикатором (метиленовым красным). Индикатор изменяет цвет (с красного на желтый) под действием кислых продуктов метаболизма при росте нормальных клеток. Если клетки заражены вирусом, то нормальный метаболизм нарушается, кислые продукты не образуются и индикатор не изменяет цвет. Таким образом, признаком размножения вирусов в клетках культуры является сохранение красного цвета среды.

15.Генетические рекомбинации у бактерий: трансформация, трансдукция и конъюгация. Плазмиды и их роль в формировании лекарственной устойчивости и патогенного потенциала бактерий.

Комбинативная (рекомбинация) связана с изменением сочетанием генов в результате внесения в генотип дополнительного генного материала. Рекомбинация осуществляется путем трансформации ,трансдукции и конъюгации. В этих процессах участвуют клетка-донор (отдает гены) и клетка реципиент(принимает гены).

Трансформация(превращение,преобразование)-изменение свойств бактериальной клетки в результате того, что фрагмент ДНК клетки-донора проникает в геном родственной бактерии. Путем трансформации могут быть перенесены различные признаки: устойчивость к антибиотикам, синтез ферментов и др.

Трансдукция-перенос генетического материала от клетки-донора к клетки-реципиенту с помощью фага. При попадание фага в клетку его нуклеиновая кислота встраивается в состав бактериальной хромосомы. При выщеплении фаговой ДНК из хромосомы возможен захват небольшого количества соседствующих генов с последующим переносом в новую бактериальную клетку. Различают неспецифическую (перенос любого фрагмента ДНК донора) и специфическую (перенос определенного фрагмента ДНК донора в определенный участок ДНК реципиента) трансдукцию. Трансдукция способствует формированию бактерий с новыми свойствами,более приспособленными к окружающей среде.

Конъюгация (соединение)-передача генетического материала от клетки к клетки осуществляется при непосредственном контакте бактерий.Способность к конъюгации связана с наличием полового фактора F (F-плазмид), который контролирует образование половых F-пилей (половые ворсинки).Их роль заключается в сближении с клеткаи реципиента и образовании цитоплазматического мостика,через который передается информация от донора к реципиенту, т. е. происходит односторонняя передача.

Плазмида-кольцевая молекула ДНК,по размерам составляет 1-3 процента генома бактерии. Эта малая часть кодирует важные генетические признаки, которые сама бактериальная хромосома не обуславливает. Количество плазмид в одной клетки может колебаться от одной до сотни. Существуют плазмиды(не связанные с хромосомой) и интегрированные (встроенные в хромосому). По функциям их делят на регуляторные(компенсируют дефекты бактериальной клетки путем встраивания в геном и восстановления функций) и кодирущие –дают клетки новую генетическую информацию (свойства, необходимые для конъюгации клеток(F-плазмиды)),устойчивость к антибиотикам (R-плазмиды) синтез энтеротоксина, выработку колицинов .Плазмиды обладают трансмиссивностью – способностью передаваться от клетки к клетке при генетическом обмене.

16. Понятие о биотехнологии. Использование методов генной инженерии для получения лечебных, диагностических и профилактических препаратов.

Биотехнология как наука является важнейшим разделом современной биологии, которая, как и физика, стала в конце ХХ в. одним из ведущих приоритетов в мировой науке и экономике.

Современная биотехнология – это наука о генно – инженерных и клеточных методах и технологиях создания и использования генетически трансформированных биологических объектов для интенсификации производства или получения новых видов продуктов различного назначения.

В рамках изучаемого курса можно выделить 3 основных части:1.Промышленная биотехнология, где рассматриваются общие принципы осуществления биотехнологических процессов, происходит знакомство с основными объектами и сферами применения биотехнологии, рядом крупномасштабных промышленных биотехнологических производств, использующих микроорганизмы.2.Клеточная инженерия. Основная цель этого раздела – знакомство с методами ведения культур клеток и практическим использованием этих объектов. В рамках этого раздела выделяют культивирование растительных клеток и методы культивирования животных клеток, так как подходы к культивированию этих объектов различаются в силу их принципиальных биологических различий. 3.Генная инженерия. Высшим достижением современной биотехнологии является генетическая трансформация, перенос чужеродных генов и других материальных носителей наследственности в клетки растений, животных и микроорганизмов, получение трансгенных организмов с новыми или усиленными свойствами и признаками.

Особое значение имеет создание методами генной инженерии диагностических, лечебных и профилактических препаратов, ранее получаемых дорогостоящими методами. Чаще всего это продукты, выделяемые из крови иммунизированных доноров, - животных и людей. Технология получения гибридом основана на выделении от доноров клеток – продуцентов и их слияния с миеломными (опухолевыми) клетками. В результате образуется гибритная клетка – гибридома, способная быстро и бесконечно размножаться и подобным способом часто получают АТ. Предшественники гибридом – плазматические клетки, синтезирующие lg опеределенного типа. Поэтому получаемые продукты получили название моноклональных АТ. Наиболее часто применяют линии миеломных клеток мышей и крыс.частота слияний в смешанной культуре клеток ( миеломных и донорских клеток – продуцентов ) невелика – одна гибридома на 104 клеток.

Образовавшиеся гибридомы немедленно реклонируют, так как многие гибридные клетки склонны «выбрасывать» лишние хромосомы, пока их число не будет равным диплоидному набору ( при этом гены, ответствееные за антителообразование, могут быть утрачены ). Гибридомы создают не только на основе В – клеток, но и Т – лимфоцитов и многих других, секретирующих лимфокины, факторы роста и т.д. Продукты, полученные технологией гибридом, применяют для леченияи профилактики различных болезней, а также для изучения строения и функций различных молекул ( например, клеточнх рецепторов). В частности, при при помощи гибридом получают моноклональные АТ, применяемые в иммуногистохимической диагностике опухолей.

17. Влияние температуры на микроорганизмы. Физические методы стерилизации. Однократные методы тепловой стерилизации. Аппаратура, режим, стерилизуемый материал. Контроль качества стерилизации в автоклаве и воздушном стерилизаторе.

Действие температуры на микроорганизмы.

Температура – важный фактор, влияющий на жизнедеятельность микроорганизмов. Для микроорганизмов различают минимальную, оптимальную и максимальную температуру. Оптимальная – температура, при которой происходит наиболее интенсивное размножение микробов. Минимальная – температура, ниже которой микроорганизмы не проявляют жизнедеятельности. Максимальная – температура, выше которой наступает гибель микроорганизмов.

По отношению к температуре различают 3 группы микроорганизмов:1. Психрофилы (холодолюбивые). Оптимум – 10 - 15С, максимум – 25-30С, минимум – 0-5С. Это обитатели почвы, морей, пресных водоемов (сапрофиты) и некоторые паразиты: паразиты холодолюбивых животных, некоторые виды иерсиний, клебсиелл, псевдомонад, вызывающих заболевания у человека.2. Мезофилы. Оптимум – 30-37С. Минимум – 15-20С. Максимум – 43-45С. Обитают в организме теплокровных животных. К ним относятся большинство патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

3. Термофилы. Оптимум – 50-60С. Минимум - 45С. Максимум - 75С. Обитают в горячих источниках, участвуют в процессах самонагревания навоза, зерна. Они не способны размножаться в организме теплокровных животных, поэтому не имеют медицинского значения.

Благоприятное действие оптимальной температуры используется при выращивании микроорганизмов с целью лабораторной диагностики, приготовления вакцин и других препаратов.

Тормозящее действие низких температур используется при хранении продуктов и культур микроорганизмов в условиях холодильника. Низкая температура приостанавливает гнилостные и бродильные процессы. Механизм действия низких температур – затормаживание в клетке процессов метаболизма и переход в состояние анабиоза.

Губительное действие высокой температуры (выше максимальной) используется при стерилизации. Механизм действия – денатурация белка (ферментов), повреждение рибосом, нарушение осмотического барьера. Наиболее чувствительны к действию высокой температуры психрофилы и мезофилы. Особую устойчивость проявляют споры бактерий.

Стерилизация – это процесс полного уничтожения в объекте всех жизнеспособных форм микробов, в том числе спор.

Физические методы: стерилизация высокой температурой, Уф облучением, ионизирующим облучением, ультразвуком, фильтрованием через стерильные фильтры.

Стерилизация паром под давлением.

Наиболее эффективный и широко применяемый в микробиологической и клинической практике метод.

Метод основан на гидролизующем действии пара под давлением на белки микробной клетки. Совместное действие высокой температуры и пара обеспечивает высокую эффективность этой стерилизации, при которой погибают самые стойкие споровые бактерии.

Аппаратура – автоклав. Автоклав состоит из 2-х металлических цилиндров, вставленных друг в друга с герметически закрывающейся крышкой, завинчивающейся винтами. Наружный котел – водопаровая камера, внутренний – стерилизационная камера. Имеется манометр, паровыпускной кран, предохранительный клапан, водомерное стекло. В верхней части стерилизационной камеры – отверстие, через которое пар проходит из водопаровой камеры. Манометр служит для определения давления в стерилизационной камере. Между давлением и температурой существует определенная зависимость: 0,5 атм - 112С, 1-01,1 атм – 119-121С, 2 атм - 134С. Предохранительный клапан – для защиты от чрезмерного давления. При повышении давления выше заданного, клапан открывается и выпускает лишний пар. Порядок работы. В автоклав наливают воду, уровень которой контролируют по водомерному стеклу. В стерилизационную камеру помещают материал и плотно завинчивают крышку. Паровыпускной кран открыт. Включают нагрев. После закипания воды кран закрывают лишь тогда, когда будет вытеснен весь воздух (пар идет непрерывной сильной сухой струей). Если кран закрыть раньше, показания манометра не будут соответствовать нужной температуре. После закрытия крана, в котле постепенно повышается давление. Начало стерилизации – тот момент, когда стрелка манометра показывает заданное давление. По истечении срока стерилизации прекращают нагрев и охлаждают автоклав до возвращения стрелки манометра к 0. Если выпустить пар раньше, жидкость может вскипеть из-за быстрой смены давления и вытолкнуть пробки (стерильность нарушается). Когда стрелка манометра вернется к 0, осторожно открывают паровыпускной кран, спускают пар и затем вынимают стерилизуемые объекты. Если не выпустить пар после возвращения стрелки к 0, вода может конденсироваться и смочить пробки и стерилизуемый материал (стерильность нарушится).

Материал и режим стерилизации:

а) стеклянная, металлическая, фарфоровая посуда, белье, резиновые и корковые пробки, изделия из резины, целлюлозы, древесины, перевязочный материал (вата, марля) (119 - 121С, 20-40 мин));б) физиологический раствор, растворы для инъекций, глазные капли, дистиллированная вода, простые питательные среды - МПБ, МПА(119-121С, 20-40 мин);в) минеральные, растительные масла в герметически закрытых сосудах (119-121С, 120 мин);

18. Методы дробной тепловой стерилизации. Аппаратура, режим, стерилизуемый материал. Пастеризация. Влияние биологических факторов на микроорганизмы. Действие биологических факторов на микроорганизмы.

Биологические факторы – это различные формы влияния микробов друг на друга, а также действие на микроорганизмы факторов иммунитета (лизоцим, антитела, ингибиторы, фагоцитоз) во время их пребывания в макроорганизме. Совместное существование различных организмов – симбиоз. Выделяют следующие формы симбиоза.

Мутуализм – такая форма сожительства, когда оба партнера получают взаимную выгоду (например, клубеньковые бактерии и бобовые растения).

Антагонизм – форма взаимоотношений, когда один организм наносит вред (вплоть до гибели) другому организму своими продуктами метаболизма (кислоты, антибиотики, бактериоцины), благодаря лучшей приспособленности к условиям среды, путем непосредственного уничтожения (например, нормальная микрофлора кишечника и возбудители кишечных инфекций).

Метабиоз – форма сожительства, когда один организм продолжает процесс, вызванный другим (использует его продукты жизнедеятельности), и освобождает среду от этих продуктов. Поэтому создаются условия для дальнейшего развития (нитрифицирующие и аммонифицирующие бактерии).

Сателлизм – один из сожителей стимулирует рост другого (например, дрожжи и сарцины вырабатывают вещества, способствующие росту других, более требовательных к питательным средам, бактерий).

Комменсализм – один организм живет за счет другого (извлекает выгоду), не причиняя ему вреда (например, кишечная палочка и организм человека).

Хищничество – антагонистические взаимоотношения между организмами, когда один захватывает, поглощает и переваривает другой (например, кишечная амеба питается кишечными бактериями).

Паразитизм – форма антагонистических отношений, когда один организм использует другой для обеспечения своей жизнедеятельности как источник питания и среду для обитания с причинением ему вреда (например, бактериофаги – паразиты бактерий).

Стерилизация текучим паром.

Метод основан на бактерицидном действии пара (100С) в отношении только вегетативных клеток.

Аппаратура – автоклав с незавинченной крышкой или аппарат Коха.

Аппарат Коха - это металлический цилиндр с двойным дном, пространство в котором на 2/3 заполнено водой. В крышке – отверстия для термометра и для выхода пара. Наружная стенка облицована материалом, плохо проводящим тепло (линолеум, асбест). Начало стерилизации – время от закипания воды и поступления пара в стерилизационную камеру.

Материал и режим стерилизации. Этим методом стерилизуют материал, который не выдерживает температуру выше 100С: питательные среды с витаминами, углеводами (среды Гисса, Эндо, Плоскирева, Левина), желатином, молоко.

При 100С споры не погибают, поэтому стерилизацию проводят несколько раз - дробная стерилизация - 20-30 мин ежедневно в течение 3-х дней.

В промежутках между стерилизациями материал выдерживают при комнатной температуре для того, чтобы проросли споры в вегетативные формы. Они будут погибать при последующем нагревании при 100С.

Тиндализация - метод дробной стерилизации при температуре ниже 100С. Она используются для стерилизации объектов, которые не выдерживают 100С: сыворотка, асцитическая жидкость, витамины. Тиндализация проводится в водяной бане при 56С по 1 часу 5-6 дней.

Пастеризация - частичная стерилизация (споры не погибают), которая проводится при относительно низкой температуре однократно. Пастеризацию проводят при 70-80С, 5-10 мин или при 50-60С, 15-30 мин. Пастеризация используется для объектов, теряющих свои качества при высокой температуре. Пастеризацию, например, используют для некоторых пищевых продуктов: молока, вина, пива. При этом не повреждается их товарная ценность, но споры остаются жизнеспособными, поэтому эти продукты нужно хранить на холоде.

19. Влияние излучения, ультразвука и высушивания на микроорганизмы. Нетепловые физические методы стерилизация ( УФ- лучи, ионизирующее излучение, ультразвук ).Аппаратура, режим, стерилизуемый материал. Лиофильное высушивание и его использование.Высушивание из замороженного состояния в вакууме- лиофилизация. Ее используют для сохранения культур микроорганизмов, которые в таком состоянии годами ( 10 – 20 лет) не теряют жизнеспособности и не меняют свойства. Микроорганизмы при этом находятся в состоянии анабиоза.

Метод лиофилизации используют в производстве живых вакцин против туберкулеза, чумы, туляремии, бруцеллеза, гриппа и др. болезней, в производстве пробиотиков.

Различают неионизирующие излучение (ультрафиолетовые и инфракрасные лучи солнечного света ) и ионизирующие излучение ( гамма – излучение радиоактивных веществ и электроны высоких энергий ).Ионизирующее излучение обладает мощным проникающим и повреждающим клеточный геном действием. Но летальные для микроорганизмов дозы на несколько порядков выше, чем для животных и растений.

Рентгеновские лучи ( длины волн менее 10 нм. ) вызывают ионизацию макромолекул в живых клетках. Возникающие фотохимические изменения сопровождаются развитием мутаций или гибелью клетки.

Повреждающее действие УФ – излучения в большей мере выражено для микроорганизмов, чем для животных и растений. УФ – лучи в относительно небольших дозах вызывают повреждения ДНК микробных клеток.Ультрафиолетовые лучи вызывают образование димеров тимина в молекуле ДНК, что подавляет репликацию ДНК, прекращает деление клетки и служит основной причиной ее гибели.

Ультразвук ( волны с частотой 20000 Гц ) обладает бактерицидными свойствами. Механизм его бактерицидного действия в том, что в цитоплазме бактерий образуется кавитационная полость, которая заполняется парами жидкости, возникает давление 10000 атм., что приводит к образованию высокореактивных гидроксильных радикалов, к дезинтеграции цитоплазматических структур, деполимеризации органелл, денатурации молекул. УФ – лучи, ионизирующее излучение, ультразвук используют для стерилизации различных объектов.

Стерилизация с помощью УФ – лучей основана на бактерицидном действии УФ – лучей с длиной волны 260 – 300нм.

Ее используют для обеззараживания воздуха лечебных учреждений, аптек, бактериологических боксов, лабораторий, цехов, заводов, детских учреждений; продуктов питания, питательных сред, посуды. Это метод холодной стерилизации не изменяет качество продуктов, т.к. в малых дозах не нарушает целостность макромолекул белков, витаминов, ферментов, полисахаридов. В последнее время ультрафиолетовое облучение входит практику обработки биологических препаратов – вакцин, сывороток.

При стерилизации прозрачных растворов термолабильных веществ ( некоторых белков, витаминов, антиботиков ) их наливают в посуду из кварцевого стекла тонким слоем и периодически стряхивают, т.к. УФ – лучи обладают слабой проникающей способностью.

Для этой стерилизации используют бактерицидные лампы БУВ – 15, БУВ – 30.

Ионизирующее излучение используют для стерилизации объектов, не выдерживающих термических и химических способов обработки: одноразовую пластиковую микробиологическую посуду, питательные среды, перевязочные материалы, некоторые лекарственные препараты ( антибиотики, гормоны, вакцины, сыворотки), системы для переливания крови, шприцы, зонды, катетеры, хирургический инструментарий.

В качестве источника гамма – лучей используют Со 60. Преимущество этого вида стерилизации в том, что он может быть включен в непрерывный производственный процесс, он не меняет качества продукта, не вызывает денатурации его составных частей. Но необходим контроль остаточной радиации изделий.

Бактерицидными свойствами обладает ультразвук с частотой волн 20000 Гц.

В настоящее время ультразвуковые датчики используют для стерилизации пищевых продуктов ( питательная ценность которых при этом максимально сохраняется ), при изготовлении вакцин и стерилизации некоторых объектов (лабораторного оборудования), которые портятся при действии повышенной температуры и химической стерилизации.

20. Влияние химических веществ на микроорганизмы. Химические методы стерилизации. Дезинфицирующие вещества. Механизм действия дезинфицирующих веществ.

В зависимости от природы вещества, его концентрации, длительности действия, оно может оказывать на микроорганизмы различное влияние: быть источником энергии и биосинтетических процессов, оказывать микробоцидное (убивающее) или микробостатическое (тормозящее рост), мутагенное действие или быть безразличным для их жизнедеятельности.

Например, 0,5-2% р-р глюкоза – источник питания для микроорганизмов, а 20-40% р-р оказывает угнетающее действие на них.

В то же время существуют вещества, хим. Природа которых обуславливает их противомикробные свойства.

Это: 1. Окислители ( галогены хлор, бром, йод, их соединения; перекись водорода, перманганат калия и др.)2. Поверхностно – активные в-ва, бактерицидные мыла ( сульфонол, амболан, твины).3. Соли тяжелых металлов ( ртути, серебра, меди, свинца);4. Фенол, крезол, их производные.5. Щелочи, известь, кислоты.6. Красители ( бриллиантовый зеленый, метиленовый синий, трипофлавин );7. Спирты.8. Альдегиды.

Микроорганизмы требовательны к определенной рН среды. Большинство симбионтов и возбудителей заболеваний человека хорошо растут при слабощелочной , нейтральной или слабокислой реакции. В процессе их жизнедеятельности происходит сдвиг рН, обычно в сторону кислой среды, рост приостанавливается, затем наступает гибель микроорганизмов вследствие повреждающего действия рН на ферменты ( их денатурация гидроксильными ионами),нарушения осмотического барьера клеточной мембраны.

Химические в-ва, используемые для дезинфекции – это дезинфицирующие в-ва. Дезинфектанты используют для обработки помещений, изделий и материалов. К наиболее распространенным дезинфицирующим в-вам относятся хлорная известь (0,1 – 10% р-р), хлорамин (0,5-5% р-р), фенол (3-5%), лизол (3-5%), двутретьосновная соль гипохлората кальция ДТСГК (0,1-10%), 0,1-0,2% р-р сулемы в другие соединения ртути, 70% этиловый спирт.

В микробиологической лаборатории дезинфицирующими в-вами пользуются для обеспложивания использованной посуды (пипетки, предметы стекла), рабочие места , рук.

Большинство дезинфицирующих в-в относится к группе общепротоплазматических ядов, т.е. ядов, действующих не только на микробы, но и на любые животные и растительные клетки.

Механизм действия всех дезинфицирующих в-в сводится к нарушению физико – хим-ой структуры микробной клетки. Различают след. группы дезинфектантов:1.Галогены (гипохлориты Са, Nа, йодонат, хлорамины, дибромантин, хлорная известь ) – взаимодействуют с гидроксильными группами белков.2.Спирты ( 70% этанол) – осаждают белки, вымывают из клеточной стенки липиды ( недостаток: споры бактерий, грибов, вирусы устойчивы).3.Альдегиды (формальдегид – блокирует аминогруппы белков, вызывает их денатурацию, гибель м/о).4.Кислородсодержащие средства (Н2О2, надкислоты) – денатурация белков, ферментов.5.Соли тяжелых металлов(сулема)- осаждают белки и др. орган. соед-я, гибель м/о.6.Фенолсодержащие ср-ва(лизол)- повреждают клеточную стенку, ЦПМ, коагулируют белки клетки.7.Газы (окись этилена) – нарушает структуру белков бактерий, в т.ч. и спор.

Химическая стерилизация основана на использовании антисептиков при обработке вакцин, сывороток и др. биопрепаратов. К химической стерилизации относится стерилизация р-рами антимикробных в-в и газовая стерилизация.

Стерилизация р-рами хим. средств – применяют для изделий, которые нельзя стерилизовать др. методами.

Газовая стерилизация – используют для обработки оптики, кардиостимуляторов, сложной техники, изделий из полимеров, стекла, металлов. Ее также используют для обеспложивания воздуха и различных поверхностей.

21. Понятие об асептике, антисептике, дезинфекции, стерилизации и консервации. Элементы асептики и виды антисептики. Методы дезинфекции. В-ва антисептики. Требования к консервантам.

Дезинфекция – уничтожение патогенных микроорганизмов в объектах окружающей среды с целью прерывания путей передачи и распространения инфекции. Различают следующие методы дезинфекции: 1.Физческие:а) механические ( влажная уборка, стирка, вытряхивание, проветривание);б) действие температурой: высокой (проглаживание, сухой и влажный горячий воздух, прокаливание, кипячение, сжигание), и низкой (замораживание).2. Химические – обработка объекта дезинфектами;3. Биологические (биологические фильтры, компостирование);4. Комбинированный (сочетание различных методов);

Асептика – совокупность мероприятий, предупреждающих попадание микроорганизмов из окружающей среды в ткани, полости человеческого организма при лечебных и диагностических манипуляциях, в стерильные лекарственные препараты при их изготовлении, а также в материал для исследования, питательные среды, культуры микроорганизмов при лабораторных исследованиях.

С этой целью в бактериологических лабораториях посевы производят у пламени спиртовки, предварительно прокаленной (затем остуженной) петлей, для посева используют стерильные питательные среды.

Асептика достигается стерилизацией хирургических инструментов и материалов, обработкой рук хирурга перед операцией, воздуха предметов операционной, поверхности кожи в операционном поле.

Т.о., элементы асептики – это:1) Стерилизация инструментов, приборов, материалов;2) Специальная (антисептическая) обработка рук перед асептической работой;3) Соблюдение определенных правил работы (стерильный халат, маска, перчатки, исключение разговоров и т.п.);4) Осуществление специальных санитарно- противоэпидемических и гигиенических мероприятий(влажная уборка с дез. средствами, бактерицидных ламп,боксов).

Асептика неразрывно связана с антисептикой, которую впервые в хирургическую практику применил Н.И.Пирогов (1865) и Д. Листер (1867). Различают след. виды антисептики:

1.Механическая (удаление из раны инфицированных и нежизнеспособных тканей);2.Физическая (гигроскопические повязки, гипертонические растворы, УФО, лазер);3.Химическая (применение химических веществ с антимикробным действием: мирамистин, хлоргексидин);4.Биологическая (применение антибиотиков, бактериофагов и др.);

Антисептики – это химические вещества, убивающие или подавляющие размножение различных микроорганизмов, находящихся на коже и слизистых оболочках микроорганизма.

В качестве антисептиков используются различные химические соединения антимикробного действия: 70 – градусный этиловый спирт, 5 % спиртовой р-р йода; 0,1% р-р марганцевокислого калия, 1-2 % р-р метиленового синего или бриллиантового зеленого; 0,5 – 1% р-р формалина.

Антисептики по химической природе подразделяются на:

1.Фенолы ( их производные – гексахлорофен).2.Галогены (соединения йода).3.Спирты (этанола 70% водный р-р).4.ПАВ (мыла. Детергенты).5.Соли тяжелых металлов ( аргентум, купрум, ртуть, цинк).6.Красители (бриллиантовый зеленый).7.Окислители ..8.Кислоты ( борная, салициловая, бензойная).9.Щелочи (нашатырный спирт).

К консервации лекарственных средств прибегают в тех случаях, когда невозможна стерилизация лекарства или невозможно изготовление их в упаковке одноразового использования. Консерванты добавляют а ЛС, содержащие в-ва, легко поражаемые бактериями, предназначенные для многократного использования. Консерванты вводят в состав как стерильных, так и нестерильных ЛС для предотвращения роста микроорганизмов, попадающих в них во время технологического процесса или при неоднократном употреблении. Они не должны использоваться, чтобы замаскировать низкое качество производства, их следует применять только при строгой необходимости. Консерванты применяют для некоторых инъекционных р-ров, глазных капель, жидких неинъекционных, мягких лек.форм.

Требования к консервантам:1.Должны быть фармакологически индифферентными.2.Иметь широкий антимикробный спектр.3.Не взаимодействовать с лек. веществами.

4.Поддерживать микробную чистоту лекарства в течение всего времени его применения.5.Быстрота биоцидного действия.6.Стабильность.

По химической природе различают след. группы консервантов:1.Альдегиды (формальдегид).2.Гуанидина производные (производные хлоргексидина).3.Кислоты неорганические и их соли( кислота борная, натрия сульфат).4.К-ты органические и их соли (бензойная, салициловая, сорбиновая, дегидроацетовая).5.Ртути органические соединения ( мертиолат, фенилртуть азотнокислая, фенилртуть борнокислая, фенилртуть уксуснокислая).

22. Нормальная микрофлора организма человека, ее значение. Дисбиозы. Лекарственные препараты и БАДы для восстановления нормальной микрофлоры: пробиотики, пребиотики и синбиотики.

Нормальная микрофлора - совокупность микробных биоценозов (сообществ) в организме здоровых людей.В норме – около 500 видов.Встречаются как безвредные, так и болезнетворные м/о.

Микрофлору делят на 2 группы:

-аутохтонная (резидентная) – постоянно, закономерно встречающиеся м/о, max приспособленные к организму человека (сапрофиты, условно-патогенные).

- аллохтонная (транзиторная) – необязательные, временно встречающиеся м/о, их присутствие определяется поступлением из внешней среды и состоянием иммунитета (сапрофиты, условно-патогенные).

Микрофлора кожи.

Видовой состав: споры грибов, бактерий; сарцины, дифтероиды, актиномицеты, плесневые и дрожжеподобные грибы, коринебактерии, микобактерии,стафилококки, (St. aureus-5%), стрептококки.

Микрофлора верхних дыхательных путей.

Большая часть – в рото- и носоглотке. Трахея и бронхи – стерильны.Видовой состав: бактероиды, пептококки, коринеформные бактерии, гемофильные палочки, непатогенные нейссерии, лактобактерии, стафилококки, стрептококки (Str. mitis -80-90%). У носителей – гемолитические стафилококки, стрептококки, дифтерийная палочка, менингококки, туберкулезная палочка, вирусы гриппа.

Микрофлора ротовой полости:Около 100 видов. В 1 мл – до 1 млн. м/тВ 1мг зубного налета – 250 млн. м/т

Состав: стрептококки, лактобациллы, вейлонеллы, нейссерии, коринебактерии, бактероиды,спирохеты, дрожжеподобные грибы, актиномицеты, микоплазмы, простейшие.

Главную роль в формировании микрофлоры играет слюна.

Бактерицидные свойства: лизоцим, лактоферрин, пероксидаза, нуклеаза,Ig A.Микрофлора полости рта - одна из причин кариеса.

Микрофлора желудка.

Желудочный сок имеет кислое значение рН и вызывает гибель м/о. Является барьером от проникновения в кишечник патогенных и условно-патогенных микробов.Всего обнаруживается 4-5 видов: сарцины, дрожжи, лактобациллы, споры, грибы, энтерококки.

Микрофлора тонкого кишечника:

Немногочисленна, т.к. кишечный сок, желчь обладают антимикробным действием.В верхних отделах число м/о – не более 100 – 1000.Обнаруживаются бифидобактерии, клостридии,эубактерии, лактобациллы, анаэробные кокки.

Микрофлора толстого кишечника: Около 260 видов.В 1 г фекалий – до 250 млрд. микробных клеток.

Значение микрофлоры:

Сложившиеся биоценозы поддерживают нормальные физиологические функции и играют определенную роль в иммунитете.Характеристика нормальной микрофлоры имеет большое значение для оценки физиологического и иммунологического статуса организма человека.

Отрицательное значение микрофлоры:

-условно-патогенные м/о при снижение резистентности могут вызвать заболевания – эндогенные инфекции (гнойно-воспалительные процессы и др.);

- энтеропатогенные серовары E. coli вызывают коли- и гастроэнтериты у детей, эшерихиозы – у взрослых;

-микрофлора полости рта – причина кариеса;

-являются источниками генов лекарственной устойчивости;

-м/о кожных покровов – причина угревой сыпи, заболеваний – пиодермии, фурункулеза.

Дисбактериоз (дисбиоз):

-количественные и качественные изменения состава нормальной микрофлоры (бактерий и других групп м/о); нарушение нормального биоценоза (нарушение эубиоза);

-может измениться и среда обитания;

-при этом наблюдается утрата нормальных функций микрофлоры;

-лежит в основе многих болезней или сопровождает болезни.

Факторы:

Эндогенные:

-понижение секреции соляной кислоты;

- недостаточная секреция поджелудочного сока;

-аллергические заболевания;

-врожденные иммунодефициты.

Экзогенные:

-широкое и бесконтрольное применение антибиотиков;

-лучевая и химиотерапия;

-иммуносупрессивная терапия;

-стрессы;

- употребление нетрадиционных продуктов питания;

-операции на ЖКТ и др.

Дисбактериоз характеризуется:

1. Резкое уменьшение общего количества м/о (некоторые виды полностью исчезают).2.Доминирование видов, которые в норме представлены в минимальном количестве (или совсем не выявляются): р. Pseudomonas, р.Proteus,р.Klebsiella, грибы р.Candida, стафилококки.

Препараты и БАДы для восстановления нормальной микрофлоры.

Пробиотики- живые (лиофильно высушенные) м/о или их метаболиты, которые нормализуют состав и функции микрофлоры.

Представители нормальной микрофлоры, обладающие выраженными антагонистическими свойствами.

К пробиотикам относятся:

1. Монокомпонентные эубиотики:

-Колибактерин: живая культура кишечной палочки штамма М-17, антагонистически активного против патогенных бактерий сем.Enterobacteriaceae.

- Бифидумбактерин: бифидобактерии.

-Лактобактерин: лактобактерии.

-Бактисубтил: Bacillus subtilis (штамм IP5832).