54. Реакции с применением меченых компонентов. Иммуноферментный анализ (ифа) и иммуноблотинг. Механизм, способы постановки, компоненты реакций и их применение.
В настоящее время широко применяются серологические реакции с меченными тем или иным способом компонентами (антителами – АТ или антигенами – АГ). Они отличаются высокой специфичностью, позволяют быстро получить результаты, поэтому используются для экспресс-диагностики вирусных и бактериальных инфекций. К ним относятся реакция иммунофлюоресценции – РИФ, иммуноферментный анализ – ИФА, радиоиммунный анализ –РИА.
В качестве меток используются:1) флюорохромы – вещества, способные флюоресцировать при облучении ультрафиолетом (поглощают энергию света определенной длины волны и излучают свет большей длины волны): флюоресцеина изотиоцианат (зеленый цвет), фикоэритрин (оранжевый), родамин (красный); используются в РИФ;2) ферменты: пероксидаза хрена, галактозидаза, щелочная фосфатаза; вызывают расщепление субстрата с образованием окрашенных продуктов при взаимодействии с хромогеном; используются для ИФА;3) радиоактивные метки – используются в РИА.
Иммуноферментный анализ (ИФА) – выявление антигенов или антител с помощью антител, меченных ферментом. После присоединения этих антител добавляют субстрат данного фермента, который расщепляется с образованием продуктов, реагирующих с хромогенами, и наблюдается окрашивание раствора в желто-коричневый цвет (при использовании пероксидазы) или в желто-зеленый цвет (при использовании фосфатазы). Конъюгированные с ферментом антитела сохраняют способность соединяться с гомологичным антигеном. Интенсивность окраски хромогена соответствует количеству образовавшихся комплексов АГ-АТ-фермент. Возможность использования ферментов в качестве метки обусловлена их высокой каталитической активностью и специфичностью. ИФА применяется для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных заболеваний (ВИЧ-инфекции, гепатита А, В, С, Е).
В настоящее время чаще всего используется твердофазная модификация ИФА. Ее суть заключается в том, что на твердом материале сорбируют АГ или АТ, после чего добавляют остальные ингредиенты реакции. В качестве твердофазного носителя обычно используют пластиковые планшеты (шарики, пленки, пробирки), изготовленные из синтетических инертных материалов (полистерол, метакрил и др.) АГ или АТ в высушенном состоянии длительное время сохраняют свою специфичность и способность вступать в реакции.
Этапы определения неизвестных антигенов (прямой вариант – «сэндвич» -метод).1).связывание специфичных антител с пластиком в лунках планшета;2).внесение антигенсодержащего материала;3).внесение антител той же специфичности, меченых ферментом пероксидазой;4).добавление субстрата фермента с хромогеном (например, для пероксидазы субстратом является перекись водорода, а хромоген – 5 аминосалициловая кислота, ортофенилендиамин);5).измерение количества окрашенных продуктов реакции.
Этапы определения неизвестных антител.1).связывание известного антигена с пластиком в лунках планшета;2).внесение исследуемой сыворотки;3).внесение конъюгата – антиглобулиновой сыворотки, меченой ферментом (содержит антитела к глобулинам человека);4).добавление субстрата фермента с хромогеном;5).измерение количества окрашенных продуктов реакции.
Учет результатов. При «+» реакции изменяется цвет раствора. Интенсивность окрашивания пропорциональна активности фермента, а количество фермента, присоединенного к твердой фазе, соответствует количеству АГ или АТ. Результаты реакции учитывают визуально или с помощью специального ФЭКа. Для проведения ИФА необходимы полистироловые планшеты, имеющие лунки с плоским дном и автоматические пипетки. Для количественного учета используют СФ- регистратор экстинкции при длине волны 492 нм. Применяются также автоматические анализаторы (ридеры).
ИФА характеризуется высокой специфичностью и быстротой получения результатов (4-6 час). Стабильность конъюгатов позволяет их хранить в течение длительного времени. Измерение оптической плотности проводят в оптическом диапазоне. Результаты можно оценить визуально (полуколичественно) без применения прибора. ИФА очень легко поддается автоматизации. Для повышение чувствительности ИФА необходимо использовать высокоспецифичные антитела (высокоаффинные моноклональные антитела).
Существует много методических вариантов ИФА. При непрямом варианте определения антигенов используют меченые ферментом антитела не той же специфичности, а антиглобулиновые (антивидовые – противочеловеческие) антитела. Опишите этапы постановки такого варианта определение антигенов при помощи ИФА и необходимые ингредиенты реакции. Разработаны так называемые «безреагентные» системы, в которых все необходимые компоненты иммбилизованы или импрегнированны в пористую поверхность. Для проведения анализа необходимо только нанести образец и визуально наблюдать изменение окраски.