62. Методы триангуляции. Измерение количественных параметров пиков различного разрешения.

Пик рассматривают как треугольник и площадь его рассчитываюткак площадь треугольника. Известны три метода триангуляции (triangle –треугольник). Эти методы приближенные, поскольку площадь пика аппроксимируется площадью одного из трех треугольников.

а). В первом методе триангуляции за площадь пика принимаетсяплощадь описанного треугольника, образованного касательными, проведенными к сторонам пика в точках перегиба, и отрезком, отсекаемымкасательными на основании пика (рис. 30, а).

Площадь описанного треугольника рассчитывается обычно поформуле:

S = ½ ⋅ h^'⋅ b₀ (65)

где h' – высота описанного треугольника; b₀ – ширина пика на нулевой линии.

Этот метод дает около 97% (96,8%) от площади гауссова пика. Недостатки этого метода состоят в необходимости дополнительных геометрических построений (проведение касательных), которые не всегда могутбыть выполнены легко и с достаточной точностью. Особенно это касается узких пиков. При этом точка пересечения касательных может оказаться за пределами диаграммной ленты.

б). Во втором методе триангуляции (рис. 30, б) предложено экстраполировать «прямолинейные» участки ветвей пика только вниз до пересечения с основанием и площадь рассчитывать по формуле:

S = ½ ⋅ h ⋅ b0 (66)

Этим методом находят около 80% (79,8%) от площади гауссовогопика. Здесь частично преодолеваются недостатки первого метода.

в). На практике наибольшее распространение получил третий метод триангуляции (рис. 30, в). Метод произведения высоты на ширинупика на половине его высоты. В этом случае геометрические построенияупрощаются. Процесс измерения состоит из четырех операций, а именно:

– проведение основания под пиком (интерполирование нулевойлинии между началом и концом пика);

– измерение высоты пика;

– нахождение середины высоты;

– измерение ширины пика на половине высоты.

Площадь рассчитывается по формуле:

S = h ⋅ b0,5 (67)

Этим методом находят около 94% (93,9%) от площади гауссовапика. Точность измерения площади в методе «h ⋅ b» зависит от формы иабсолютных размеров пика. Форму пика принято характеризовать отношением «h / b0,5» . Ошибка минимальна при h / b0,5 равна 5−6%. С повышением абсолютных размеров пика точность измерения площади пикавозрастает.

Истинная же площадь гауссова пика может быть найдена по формуле:

Sист = h⋅b0,368 (68)

63. Метод абсолютной калибровки и внутреннего стандарта.

Метод абсолютной калибровкиоснован на том, что для, количественного определения содержания компонентов в анализируемой пробе, необходимо для каждого определяемого в пробе индивидуального вещества построить калибровочную кривую зависимости площади или высоты хроматографического пика от содержания этого вещества в анализируемой пробе. Необходимость такой трудоемкой работы обусловлена тем, что чувствительность детектора хроматографа к различным веществам даже близкой химической структуры, как правило, неодинакова.

Построение калибровочных кривых производят по результатам хроматографирования в одинаковых условиях известных количеств определяемого вещества. Зависимость площадиS_i или высоты хроматографического пика от содержания q_i вещества в анализируемой пробе при достаточно строгом воспроизведении условий хроматографирования является линейной и угловой коэффициент (тангенс угла наклона) калибровочной прямой i-го компонента называется калибровочным коэффициентом K_i,г/см²:

(1.59)

Процентное содержание i-го компонента X_i в пробе составит

(1.60)

где Q масса анализируемой пробы, г.

Метод абсолютной калибровки достаточно прост, но точность его в значительной мере зависит от постоянства режима и тщательности приготовления и анализа эталонов или их смесей.

Недостаток метода состоит в том, что приходится строить калибровочные графики для каждого индивидуального вещества, на что тратится много времени и расходуются эталонные вещества. Поэтому его применяют, главным образом, при определении одного или нескольких компонентов смеси, например, микропримесей.

Метод внутреннего стандарта (метод метки) основан на сравнении высот или площадей пиков известного вещества-метки и определяемых компонентов. В качестве внутреннего стандарта (метки) стараются подобрать такое вещество, которое бы не реагировало с компонентами смеси, не очень сильно сорбировалось и появлялось на хроматограмме отдельно от других компонентов. Кроме того, его не должно быть в составе исследуемой смеси.

К анализируемой пробе добавляют точно известное количество вещества-метки. Количество метки подбирают такое, чтобы площадь его пика была соизмерима с площадью пиков компонентов смеси, подлежащей количественному определению. Для калибровки следует провести хроматографический анализ ряда смесей вещества-метки с каждым из отдельных определяемых компонентов при различных соотношениях обоих веществ в смеси. По оси абсцисс откладывают значения отношения массы метки q_m к массе анализируемого вещества q_i (q_m/q_i) в искусственных смесях, а по оси ординат  соответствующее им соотношение площадей пиков S_m/S_i.

В узкой области соотношений q_m/q_i график прямолинеен. Угловой коэффициент такого графика К_iпредставляет собой калибровочную константу для данного определяемого компонента. Он вычисляется из уравнения

. (1.61)

Отсюда .

Калибровочная константа практически не зависит от количества добавляемой в колонку искусственной смеси и мало изменяется при изменении скорости потока подвижной фазы и температуры колонки. Относительное содержание вещества-метки I_mв смеси рассчитывается по следующей формуле:

. (1.62)

Относительное содержание определяемого компонента I_i

, (1.63)

где  масса вещества-метки в пробе;  масса определяемого вещества в пробе;Q весовое количество пробы смеси, введенное в колонку.

Разделив I_m на I_i получаем

,. (1.64)

откуда .

Процентное содержание определяемого вещества вычисляется из уравнения

, (1.65)

а так как , то _. (1.66)

Метод метки удобен тем, что на результаты анализа колебания параметров хроматографического опыта сказываются слабо. Но если дозировка объемов анализируемых образцов проводится достаточно точно, этот метод никаких преимуществ перед методом абсолютной калибровки не имеет. Кроме того, использование метода метки ограничивается преимущественно определением лишь небольшого числа компонентов, содержание которых в не очень сложных по составу смесях не превышает примерно 10%.