48. Распределительная жидкостная хроматография.
Распределительная (жидкостно-жидкостная) хромат-фия (РЖХ) – разделение компонентов пробы обусловлено различием коэф-тов их распределения между двумя несмешивающимися между собой жидкими фазами, одна из кот. неподвижная и находится на поверхности или в порах неподвижного твердого носителя или на стенках капиллярной хроматограф. колонки, а вторая – подвижная. По характеру сил взаимод-вия, обуславливающих различное распределение в-в, имеющих разное строение, между двумя фазами, РЖХ подобна АЖХ. По технике выполнения РЖХ может быть колоночной и плоскостной (тонкослойной или бумажной). В кач-ве твердых носителей используют в-ва, индифферентные по отношению к подвижному растворителю и компонентам пробы, но способные удерживать на поверхности и в порах НЖФ. Чаще всего в кач-ве носителей используют полярные в-ва, на кот. наносится полярная НЖФ; в кач-ве ПФ при этом используют менее полярные или неполяр. в-ва (это вариант НФХ – используется для разделения полярных в-в). Во втором варианте (ОФХ – используется для разделения неполяр. в-в) носитель и НЖФ неполярны, а ПФ полярна.
Требования к подвижным жидким фазам:
должны хорошо растворять разделяемые в-ва, причем растворимость пробы в неподфижной фазе должна быть несколько больше, чем в подвижной;
растворители, используемые в кач-ве НФ и ПФ, должны быть взаимно насыщаемыми, т.е. состав раств-ля должен быть постоянен во время прохождения его через колонку;
взаимод-вие растворителя, используемого в кач-ве ПФ, с НФ должен быть миним-ным.
В РЖХ чаще используют смеси растворителей для регулирования полярности ПФ и НФ. Существенный недостаток РЖХ – достаточно быстрое смывание НЖФ с носителя. Для устранения этого недостатка часто ПФ насыщают в-вом, используемым в кач-ве НЖФ, либо НЖФ прививают на носитель химически.
49. Ионообменная, ионная, ион-парная хроматография.
Ионобменная хроматография является более частным вариантом ионной хроматографии. Этот вариант хроматографии позволяет разделять ионы и полярные молекулы, на основании зарядов разделяемых молекул.
Данный вид хроматографии позволяет разделить практически любые заряженные молекулы, в том числе: крупные — белки, малые—молекулы нуклеотидов и аминокислот. Часто ионообменная хроматография используют как первый этап очистки белков.
Принцип ионообменной хроматографии
Ионообменная хроматография позволяет разделить молекулы, основываясь на ионных взаимодействиях. Неподвижная фаза имеет заряженные функциональные группы, которые взаимодействуют с анализируемыми ионизированными молекулами противоположного заряда. Этот вариант хроматографии классифицируется на два типа — катионную и анионную ионообменную хроматографию:
Катионная ионообменная хроматография задерживает положительно заряженные катионы, так как неподвижная фаза имеет отрицательно заряженные функциональные группы, например, фосфат (PO43−).
Анионная ионообменная хроматография задерживает отрицательно заряженные анионы, так как неподвижная фаза имеет положительно заряженные функциональные группы, например, +N(R)4.
ИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ, разновидность ионообменной хроматографии, в к-рой разделяемые ионы определяют в проточном, как правило, кондуктометрич. детекторе. Анализ осуществляется в автоматизир. приборе - ионном хроматографе. В наиб. распространенном варианте ионной хроматографии используют две последовательно размещенные хроматографич. колонки. В первой ионы разделяют на поверхностно-модифицир. ионообменной смоле низкой емкости (0,01-0,1 мг-экв/г); элюентами служат сильно разб. р-ры электролитов. Вторая колонка с ионитом высокой емкости обеспечивает резкое снижение фоновой электропроводности элюента вследствие его хим. модификации. Так, при разделении смеси анионов в первой колонке используют анионит, во второй - катионит в Н+-форме, а элюентом служит р-р Na2CO3. Модификация элюента заключается в том, что Na2CO3 переводится в слабую к-ту Н2СО3, к-рая вносит малый вклад в электропроводность р-ра. При разделении смеси катионов первая колонка содержит катионит, вторая - анионит в ОН--форме; элюент НСl превращ. в Н2О. Т. обр., в кондуктометрич. проточный детектор попадает р-р, электропроводность к-рого обусловлена гл. обр. определяемыми ионами. Сигнал детектора линейно зависит от концентрации ионов. Качеств. анализ осуществляется по времени удерживания ионов, количественный - по площади хроматографич. пиков. Для повышения эффективности разделения процесс осуществляют под давлением. Использование очень разб. р-ров элюента позволяет в ряде случаев обходиться и без второй колонки (т. наз. ионная хроматография без подавления). При этом чувствительность анализа обычно ниже. Ионная хроматография особенно удобна для определения неорг. ионов (Сl-, Br-, NO3-, SO42-, SeO42-, РО43-, AsO43- и др.) и карбоновых к-т. Можно также определять катионы щелочных и щел.-зем. металлов и нек-рые амины. Достоинства ионной хроматографии: низкие пределы обнаружения ионов (до 10-3 мкг/мл, а с применением спец. колонки для предварит. концентрирования - до 10-5-10-6 мкг/мл), высокая селективность, возможность одновременного определения неорг. и орг. ионов, экспрессность (за 20 мин можно определить до 20 ионов); широкий интервал определяемых концентраций (0,01 мкг/мл - 100 мг/мл); малый расход пробы (0,1-0,5 мл), простота подготовки пробы к анализу. Ионную хроматографию применяют при анализе прир. и сточных вод, почв, пищ. продуктов, лек. ср-в и др. объектов. Возможности метода расширяются благодаря использованию разл. детекторов - атомно-абсорбц., фотометрич., люминесцентных, кулонометрич., потенциометрических.
Ион-парная хроматография – метод, контролирующий удерживание и селективность добавлением ион-парного агента в подвижную фазу, и может быть использована для образцов, содержащих как ионные, так и неионныне компоненты. Чаще всего используют обращено-фазовые сорбенты. В качестве элюентов в этом режиме наиболее распространены системы метанол/вода и ацетонитрил/вода. Основное ограничение при выборе элюента: растворять ион-парный агент.
Обеспечивает возможность разделения ионных соединений на неполярном (например, С18) сорбенте. Введение ион-парной добавки приводит к увеличению факторов емкости. Фактор емкости пропорционален концентрации противоиона
Ион-парная хроматография может быть реализована в режимах нормально- и обращено-фазовой хроматографии.
Увеличение концентрации противоиона в подвижной фазе вызывает повышение фактора емкости в обращено-фазовом режиме и снижению в нормально-фазовом режиме. Повышение концентрации противоиона в неподвижной фазе – наоборот.
Удерживание пропорционально способности противоиона образовывать ионную пару, размеру противоиона и в определенных пределах его концентрации.Если факторы емкости слишком велики, используют добавление к элюенту органического растворителя. Что приводит к снижению удерживания.
50. Эксклюзионная хроматография. Эксклюзионная хромат-фия (ЭХ) – разновидность ЖХ, в кот. разделение компонентов пробы основано на распределении молекул в-ва между растворителем, протекающем в порах сорбента, набухающего в ПФ, и растворителем, протекающем между его частицами в соответствии с размерами молекул анализируемого в-ва. В процессе разделения небольшие молекулы анализ. в-ва попадают в сетку полимера, в порах кот. растворитель является НФ, и удерживаются там. Большие молекулы проникнуть в полимерную сетку не могут и вымываются из колонки. Поэтому из колонки будут вымываться сначала самые большие молекулы. ЭХ может быть гель-проникающей (Г-П) и гель-фильтрационной (Г-Ф). В Г-П ЭХ разделение осущ-ся на полимерах, набухающих в орг. растворителях, в Г-Ф ЭХ разделение осущ-ся на полимерах, набухающих в воде. Удерживание молекул в хроматографич. колонке эксклюзионного типа опред-ся их диффузией в поры сорбента и зависит от размера молекул пробы и от размера пор НФ.Если на механизм разделения, основанный на распределении молекул по размерам, не наклад-ся др. механизм, то изотерма распределения линейна. НФ в ЭХ выбирают для решения конкр. задачи. Первонач-но устан-ют, какая система растворителей может быть использована для анализа. В зав-сти от этого выбирают сорбент. Разделение водорастворимых многокомпонент. смесей проводят на НФ, представляющих собой мелкие сферич. гранулы декстрана или полиакриламида. Это гидрофильные набухающие в воде сорбенты. Разделение смеси, растворимой в орган. растворителях, проводят на гидрофобных сорбентах – полстирольные гели с разл. степенью сшивки. Для повыш. скорости хромат-вания Эх часто проводят под давлением. При этом в кач-ве НФ используют гели с жесткими матрицами. Т.к. силикагели обладают дост-но выс. адсорбцион. спос-стью, что нежелательно для ЭХ, их поверхность подвергают силанизированию или подбирают элюент, подходящий по полярности. ПФ, используемые в ЭХ, должны быть хорошими растворителями (т.е. полностью растворять пробу), хорошо смачивать сорбент, иметь низкую вязкость и токсичность, предотвращать или затруднять адсорбцию компонентов. Чаще всего в кач-ве ПФ используют воду, тетрагидрофуран, толуол. ЭХ применяется чаще всего при проведении анализов полимеров при определении молекулярно-массового распределения в полимерах. Детектирование в ЭХ проводится с использованием дифференциальных рефрактометров и интерферометров. При определении молекулярно-массового распределения строят градуировочные графики зависимости удерживаемого объема от молекул. массы данного полимера по образцам, имеющим очень узкое молекулярно-массовое распределение.
51. Классифицируйте методы тонкослойной и бумажной хроматографии. Основные достоинства и недостатки данных методов. Тонкослойная и бумажная хроматографии относятся к плоскостной хроматографии. Бумажная и тонкослойная хроматографии сходны по технике выполнения. В качестве неподвижной фазы в бумажной хроматографии применяется целлюлозное волокно бумаги, в тонкослойной хроматографии различные сорбенты (Al2O3, силикагель и др.), нанесенные равномерным тонким (100300 мкм) слоем на стеклянную, металлическую или пластиковую подложку (носитель). Слой адсорбента на носителе может быть закреплен или незакреплен. Бумажная (БХ) и тонкослойная хроматография (ТСХ) по механизму разделения относятся к распределительной хроматографии. В методе БХ носителем является специальная хроматографическая бумага с определенными свойствами. Неподвижной фазой служит вода, адсорбированная на поверхности и порах бумаги (до 20%), подвижной органический растворитель, смешивающийся или несмешивающийся с водой, вода или растворы электролитов. В методе ТСХ процесс разделения смеси веществ осуществляется в тонком слое сорбента, нанесенного на инертную твердую подложку, и обеспечивается движением подвижной фазы (растворителя) через сорбент под действием капиллярных сил. По механизму разделения различают распределительную, адсорбционную и ионообменную хроматографию. Разделение компонентов происходит в этих случаях либо в результате их различного коэффициента распределения между двумя жидкими фазами (распределительная хроматография), либо вследствие различной адсорбируемости соединений сорбентом (адсорбционная хроматография). Адсорбционный метод основан на разной степени сорбции-десорбции разделяемых компонентов на неподвижной фазе. Адсорбция осуществляется за счетван-дер-ваальсовских сил, являющейся основой физической адсорбции, полимолекулярной (образование нескольких слоевадсорбата на поверхности адсорбента) и хемосорбцией (химического взаимодействия адсорбента и адсорбата). Существует несколько вариантов ТСХ и БХ, различающихся способом подачи растворителя. В зависимости от направления движения подвижной фазы различают: а) восходящую хроматографию подвижную фазу наливают на дно разделительной камеры, бумага (пластинка) ставится вертикально; б) нисходящую хроматографию подвижная фаза подаётся сверху и перемещается вниз вдоль слоя сорбента пластины или бумаги; в) радиальную хроматографию горизонтальное продвижение фронта растворителя: подвижная фаза подводится к центру бумажного диска (пластины), куда нанесена разделяемая смесь.
Эффективность БХ и ТСХ также зависит от селективности и чувствительности реакций, используемых для обнаружения компонентов анализируемой смеси. Обычно используют реагенты, образующие с определяемыми компонентами окрашенные соединения проявители.