6.1.2. Транскрипция у эукариот
В общем плане, процесс транскрипции у эукариот сходен с процессом транскрипции у прокариот, но имеются и некоторые различия:
1 - транскрипция у эукариот происходит в ядре, а не цитоплазме, как у прокариот;
2 - РНК-полимеразы у эукариот бывают 3 видов: РНК-полимераза I, II, III (далее pоl I, роl II, роl III);
3 - для эукариот характерно наличие энхансеров, регулирующих транс- крипцию;
4 - процессингу подлежат все виды РНК: мРНК, тРНК и рРНК;
5 - факторы транскрипции у эукариот более многочисленны и сложно устроены.
Структура РНК-полимераз у эукариот изучена не полностью. Известно, что все эти ферменты крупнее прокариотической РНК-полимеразы; содержат 2 крупные субъединицы и 10-15 малых.
РНК-полимераза I синтезирует крупные рРНК: 28S, 18S, 5,8S и локализована в ядрышке; РНК-полимераза II - мРНК и мя-РНК (ма- лые ядерные РНК, участвующие в процессинге РНК) и локализована в кариоплазме; РНК-полимераза III - тРНК, 5S РНК и локализована в кариоплазме.
Промоторы эукариот аналогичны прокариотическим промотором (рис.109) и имеют несколько сайтов связывания РНК-полимераз. На 5′-конце промотора для РНК-полимеразы II левее точки начала транскрипции на расстоянии 30 нуклеотидов расположена консенсусная последовательность 5′-ТАТАААА-3′ (ТАТА-бокс) или бокс Гольдберга-Хогнесса, которая встречается практически у всех эукариотических генов и поэтому считается не специфическим сайтом связывания. На расстоянии 70-80 нуклеотидов расположена последовательность 5′-ГГЦЦААТЦ-3′ (ЦААТ-бокс), которая характерна для большинства генов и регулирующая частоту транскрипции. На расстоянии 110 нуклеотидов у многих генов встречается еще одна последовательность: 5′ -ГГГЦГГ-3′ (ГЦ-бокс).
Рис.109. Промоторы эукариот.
Еще одна последовательность ДНК, с которой связываются факторы транскрипции – это энхансер. Энхансеры могут располагаться на 5′- и на 3′-концах гена, а также внутри него на разных расстояниях от гена (до 50 тыс. н.п.). Положение энхансера не влияет на его активность.
При связывании энхансеров с факторами транскрипции, ДНК делает изгиб или петлю, сближая энхансер с геном, активность которого он контролирует (рис.110).
Рис110. Изменение положения цепей ДНК, обеспечивающее
сближение энхансера с промотором.
Другая последовательность ДНК - сайленсер, блокирует транскрип - цию. Белки группы SIR (sailent information регулятор) связываются с сайленсерами, окупируя при этом большие области ДНК и закрывая, тем самым, доступ факторам транскрипции. При этом репрессируется все гены на расстоянии в несколько тыс.п.н. от сайленсера.
Ни одна РНК-полимераза не способна самостоятельно связываться с промотором.
Для связи РНК-полимераз с промотором имеются специальные белки – факторы транскрипции (ТF-факторы). В зависимости от того, какую РНК-полимеразу связывают ТF-факторы, их называют ТFI, ТFII, ТFIII. Латинская буква, следующая за римской цифрой, обозначает, каким по счету был открыт этот фактор: ТFIIА, ТFIIВ, ТFIIД и т.д. Различные факторы соединяются с молекулой ДНК на разных сайтах. Например, ТFIIД соединяется с ТАТА-боксом, поэтому его называет ТАТА-фактором.
Факторы транскрипции имеют общую особенность в строении своих белковых молекул, которые обеспечивают способность взаимодействия их аминокислотных последовательностей с нуклеотидами ДНК. В этих белках имеются специальные домены (см. Структура белка), образующие особую трехмерную структуру или мотив. Известно 3 основных мотива:
1 – «спираль-виток-спираль» характерен для многих генов, особенно для генов, контролирующих развитие и дифференцировку организма, так называемые гомеотические гены. Они имеют последовательность из 108 н.п. - гомеобокс, которая кодирует гомеодомен – участок из 60 аминокис- лот, формирующих мотив спираль- виток-спираль. В этом мотиве α-цепи белка разделены «витком» из нескольких аминокислот (рис.111), которые позволяют белку связываться с ДНК;
Рис.111. Мотив «спираль-виток-спираль». А - α-спираль белка, содержащая 3 домена; b - домены связываются с большими бороздками спирали ДНК.
2 - «цинковые пальцы» - мотив, в котором молекула белка образует петлю (палец). Петля содержит 23 аминокислоты; остатки цистеина и гистидина в ней связаны с атомом цинка (рис.105). Эти петли и связываются и взаимодействует с молекулой ДНК;
3 - «лейциновая застежка» (или «молния»). Этот мотив содержит 4 домена: 2, богатых лейцином и 2,богатых положительно заряженными аминокислотами. Домены, богатые лейцином образуют «застежку» по типу молнии, за счет взаимодействия между лейцинами этих доменов (рис.112).
Такое взаимодействие стабилизирует структуру мотива, а домены, богатые положительно зараженными аминокислотами связываются с молекулой ДНК.
Факторы транскрипции делятся на общие, обеспечивающие связывание с ТАТА-боксом и специфические, связывающиеся с боксами промотора ЦААТ, ГЦ и энхансерами. Кроме того, существует группа бел-
Рис.112. Мотив белка «лейциновая застежка»: А – структура мотива, Б –
схема связывания с молекулой ДНК (по М.Сингер, П.Берг, 1998)
ков, которые способствуют связи факторов активации и репрессии транскрипции с молекулой ДНК. Эти белки получили название медиаторов (посредников). Одни действует на хроматин, ослабляя связь гистонов с молекулой ДНК и обеспечивая деспирализацию ДНК на участке транскриптона (комплекс белков SWI/SNF); другие передают сигнал от энхансера (R-белки), третьи активирует РНК-полимеразы, обеспечивая инициацию транскрипции (9 белков SРВ) и связь с белками, участвующими в элонгации РНК.
На 1 этапе транскрипции РНК-полимераза должна связаться с промотором. Наиболее детально этот этап изучен для РНК-полимеразы II, каталитирующей синтез мРНК.
Рис.113. Инициирующий комплекс, образованный общими факторами транскрипции: R-белки, передающие сигнал от энхансера; А, В,Д,Е,F,Н-ТАF-белки; Srb, Gаl11, Меd- белки медиатора, SWI/ SNТ- белки деспирализующие хроматин
Процесс связывания РНК-полимеразы с промотором облегчает инициирующий комплекс, состоящий из множества белков – общих факторов транскрипции ТFIIД (рис.113).
Первым с промотором транскриптона связывается белок, узнающий ТАТА-бокс: ТАТА-связывающий белок ТВР (рис.113-114), после чего с ТВР связываются еще 10 белков – ТВР-ассоциированных факторов или ТАF-белки (ТВР-associated factors). ТВР-белок и ТАF-белки вместе составляют комплекс общих факторов транскрипции ТFIIД, который обеспечивает связывание с РНК-полимеразой II еще ряда активирующих транскрипцию комплексов: ТFIIВ, ТFIIF, ТFIIЕ и ТFIIН (рис.114). Каждый из этих комплексов выполняет свою функцию: ТFIIА (3 субъединицы) стабили- зирует связь ТВР с промотором, ТFIIВ (1 субъединица) обеспечивает узнавание точки начала транскрипции; ТFIIF (2 субъединицы) стимулирует элонгацию, ТFIIН (7 субъединиц) обеспечивает расплетание спирали ДНК, то есть, обладает функцией хеликазы. Все эти комплексы функционируют в клетках любого типа и также является общими факторами транскрипции.
Рис.114. Схема сборки транскрипционного
комплекса у эукариот.
После
присоединения всех этих комплексов
образуется единый
инициирующий транскрип- ционный комплекс.
Его образование сопровождается раскрытием
двуцепочной молекулы ДНК, формируется
транскрипцион- ный глазок и начинается
транскрипция. После образо- вания
молекулы РНК длиной в 8-10 нуклеотидов,
РНК-полимераза покидает промо- тор и
начинается этап элонгации.
Последний момент инициации связан с вступле- нием в транскрипцию энхан- серов и многочисленных факторов регулирующих ско- рость транскрипции. Эти фак- торы связываются с энхансе- ром и транскрипционным комплексом (рис.115). В результате образется петля, сближающая энхансер и промотор.
Элогация цепи РНК у эукариот подобна таковой у прокариот: синтез РНК идет согласно принципу комплементарности; РНК –полимераза двигает по матричной цепи ДНК в направлении 5′→3′. В молекуле РНК-полимеразы имеются центры связывания с молекулой ДНК и растущей цепью РНК; по мере движения РНК-полимеразы происходит локальные расплетание молекулы ДНК и восстановление ее структуры после ухода с этого участка фермента, то есть, транскрипционный глазок перемещается.
Скорость синтеза РНК у эукариот составляет 5-10 нуклеотидов в секунду.
Рис.115. Схема расположения энхансера и факторов транскрипции (Из: Клаг, 2009)
Точность спаривания нуклеотидов при транскрипции ниже точности репликации, так как, у РНК-полимераз отсутствует система коррекции ошибок; она лишена 3′→5′- и 5′→3′-экзонуклеазной активности. В результате частота ошибок составляет 1ошибку на 103-104 нуклеотидов. Ошибки транскрипции не приводят к изменению фенотипа, поскольку одновременно синтезируется множество копий РНК, а также благодаря свойству генетического кода – вырожденности, когда замена одного нуклеотида не изменяет смысл кодона (см. Генетический код).
Процесс элонгации у эукариот регулируется группой белковых факторов элонгации: Р-ТЕFв - препятствует прекращению элонгации, вызванной действием ингибиторов; SII и ТFIIF контролируют активность РНК-полимеразы, как на стадии инициации, так и на стадии элонгации; SIII (элонгин) содержит 3 субъединицы, выполняющие функции активации и регуляции транскрипции, устранение задержки транскрипции. Мутация этого фактора приводит в возникновении многих видов рака у человека.
Терминация транскрипции у эукариот происходит также, как у прокариот в участках ДНК, богатых ГЦ-последовательностями. Освобождение РНК-полимеразы и вновьсинтезированной РНК из транскрипционного комплекса обеспечивают три фактора терминации: для РНК-полимераза I - белки Rев-1 и ТТF-1, для РНК-полимеразы II - белок N-ТЕF, для РНК-полимеразы III - Lа-белок. Все эти факторы связываются со стоп-сигналами на молекуле ДНК и останавливают РНК-полимеразы. В этот момент, происходят конформационные изменения молекул РНК-поли- мераз и это приводит к ослаблению связей между участками транскрипционного комплекса и его распаду. Освобождение РНК и РНК-полимераз происходит при участии дополнительных факторов RТFR (polymerase and transcript release factors).
Рис.116. Конвейерной характер синтеза РНК: Е - РНК-полимеразы
В результате транскрипции синтезируется молекулы – предшест- венники активных РНК: пре-рРНК, пре-мРНК и пре-тРНК (рис.117).
Пре-мРНК в несколько раз длиннее зрелых РНК, так как включают транскрипты спейсеров ДНК и интроны, которые образуют «шпильки» Кроме того, длина пре-мРНК значительно варьирует у разных молекул от 2 тыс.п.н. до 20 тыс. п. н., поэтому её называют гетерогенной ядерной РНК (гя-мРНК). У нее отсутствует на 5′-конце «колпачок» (кэп), а на 3′-конце – поли (А) фрагмент. Пре-мРНК могут нести информацию об одном полипептиде или нескольких, расположенных на ДНК кластерами (гистоновые гены), и в этом случае пре-мРНК является полицистронной (в дальнейшем из нее образуется несколько зрелых м-РНК).
Рис.117. Схемы пре-мРНК, пре-рРНК и пре-тРНК
Пре-рРНК транскрибируется как единое целое, содержит информацию о трех генах рРНК и, впоследствии, образует зрелые р-РНК: 18S-; 5,8S-; и 28SрРНК. Эти последовательности разделены спейсерами, но не содержат интронов .
Пре-тРНК всегда содержат последовательность только одной зрелой тРНК. Она уже имеет вид «кленового листа», но не содержит минорных нуклеотидов, не сформирован кодон акцепторной петли (ЦЦА) и антикодон не занимает своего правильного места.
Превращение пре-РНК в зрелые РНК осуществляется в ходе процессинга.