3.2. Поверхностный аппарат ядра

Поверхностный аппарат ядра или кариотека ( греч. tece- футляр, коробка) представлен ядерной оболочкой, поровыми комплексами и ламиной. Его функция - изоляция кариоплазмы от цитоплазмы.

Ядерная оболочка или кариолемма - мембранная структура, имеющая такой же план строения, как и все биологические мембраны, но состоящая из двух мембран. Она отделяет цитоплазму от ядра. Такое разделение обеспечивает обособление процессов синтеза белка и процессов синтеза нуклеиновых кислот. Это создает необходимые возможности для регуляции активности генов и ее реализации в виде синтеза специфических белков. Через ядерную оболочку осуществляется транспорт веществ из цитоплазмы в ядро и из ядра в цитоплазму. Обмен макромолекул, таких, как белки и РНК, между ядром и цитоплазмой осуществляется через ядерные поры, образованные белковым комплексом. Поры регулируют транспорт через ядерные мембраны. Пептиды и небольшие белки, например, гистоны, способны легко проникать в ядро. Более крупные белки (свыше 40 кДа) могут пройти через ядерную мембрану, только если они несут специальную сигнальную последовательность. Такая последовательность состоит из 4 основных аминокислот.

Ядерная оболочка принимает участие в организации трехмерной структуры интерфазного ядра; её элементы являются частью ядерного белкового матрикса.

Ядерная оболочка состоит из двух мембран - наружной и внутренней, между ними располагается перинуклеарное пространство (рис.167,168,169). Внутренняя мембрана ядерной оболочки структурно связана с ламиной - периферическим слоем ядерного белкового матрикса. Особенностью ядерной оболочки, отличающей ее от других двухмембранных структур клетки (митохондрий и пластид) является наличие особых ядерных пор.

Наружная мембрана ядерной оболочки контактирует с цито - плазмой клетки. Ей характерны некоторые структурные особенности ( например, наличие на её поверхности большого количества рибосом), благодаря которым наружную мембрану можно считать продолжением собственно мембранной системы эндоплазматической сети (ЭПС). Имеются данные о непосредственном переходе на отдельных участках внешней ядерной мембраны в систему каналов эндоплазматической сети, что говорит о структурной идентичности этих мембран (рис.168). Между двумя мембранами имеется перинуклеарное пространство шириной 20-40 нм, со­держащее продукты биосинтеза белка и аналогичное полости ЭПС (рис.167). Со стороны цитоплазмы наружная мембрана окружена сетью промежуточных виментиновых филаментов (ПФ).

Рис. 166. Участок периферии ядра: 1 -наружная мембрана ядерной оболочки; 2 - перинуклеарное пространство; 3 - внутренняя мембрана ядерной оболочки; 4 - ядерные поры; 5 -ламины; 6 - хроматин; 7 - мембраны ЭПС (Из: Интернет-ресурсы – Ядро. Структура и функции)

Наружная мембрана может участвовать в синтезе белкового и липидного компонентов мембран, подобно ЭПС. При этом от наружной ядерной мембраны отщепляются мембранные вакуоли, которые транспортируются к цис-полюсу аппарата Гольджи. Состав липидов и белков наружной ядерной мембраны подобен белкам и липидам ЭПС. Рибосомы на поверхности наружной мембраны синтезируют мембранные и секретируемые белки, транспортируемые затем в перинуклеарное пространство, а оттуда в полости цистерн ЭПС. Наружная мембрана ядерной оболочки может образовывать различной величины выпячивания или выросты в сторону цитоплазмы (рис.167,Е).

Рис. 167. Участок ядерной мембраны: А - перинуклеарное пространство, ограниченное двумя мембранами; Б – наружная и В – внутренняя мембраны; Г - ядерная пора и белки, утопленные либо пересекающие перинуклеарное пространство; Д – промежуточные филаменты; Е – выпячивания наружной мембраны; Ж - ядерная ламина (синие "нити" на схеме), связанная как с мембранно-ассоциированными белками, так и с хроматином; З – кариоплазма; И - белки, связывающие кариолемму с ламиной (Из: Интернет-ресурсы – Ядро. Структура и функции)

Внутренняя мембрана кариолеммы гладкая, рибосом на своей поверхности не имеет. Ряд структурных белков ядерного матрикса (LBR, MAN, BAF, SUN и др.) связывают её с плот­но прилегающей к ней ядерной ламиной (волокнистая сеть промежуточных филаментов) - пластинкой, толщиной 300 нм (рис.167,И). С ламиной контактируют промежуточные филаменты (рис.167,Д), форми­рующие в ядре фибрил - лярную сеть и образующие кариоскелет. Связь хроматина с внутренней мембраной оболочки является ее характерной особенностью. Кроме того, внутренняя мембрана участ­вует в формировании кариолеммы при делении клеток.

Рис. 168. Участок ядерной мембраны: 1 – рибосомы , связанные с мембраной ЭПС; 2 – цистерны ЭПС, сообщающиеся с перинуклеарным пространством; 3 – ядерный поровый комплекс; 4 –наружная и 5 – внуренняя мембраны; 6 – интегральные белки внутренней мембраны и дополнительный белки, связывающие хроматин и ламину; 7 - ядерная ламина, состоящая из белков-ламинов A, B, C, изображена в виде тройной волнистой линии; 8 – хроматин (BAF - хроматинсвязы - вающий белок) (Из: Интернет-ресурсы – Ядро. Структура и функции)

Две ядерные мембраны в отдельных участках переходят одна в другую (рис.168-3). Эти места являются порами кариолеммы или ядерными порами.

Ядерные поры (рис.169) - это гигантские макромолекулярные комплексы (ядерные пóровые комплексы), которые обеспечивают обмен белков и рибонуклеопротеидов между ядром и цито­плазмой.

Ядерный пóровый комплекс (ЯПК) имеет молекулярную массу более 125·10⁶ Да; состоит из более 200 белков, организованных в 16 субъединиц. Белки ЯПК называются нуклеопорины. ЯПК имеет вид цилиндра с внешним диаметром порового комплекса около 100 нм и высотой - 75 нм (рис.170). Белки ЯПК образуют гранулярные и фибриллярные струк - туры. По границе округлого отверстия в ядерной оболочке располагается три ряда гранул по 8 в каждом: один ряд лежит со стороны ядра, другой - со стороны цитоплазмы, третий расположен между ними в центральной части поры.

Рис.169. Поровые комплексы в ядерной

оболочке дрожжевой клетки (Из:Интер

нет-ресурсы – Ядро. Структура и функ -ции)

По краю поры, обращенному к цитоплазме лежат 8 субъединиц в виде гранул (рис.170), образующих цитоплазматическое кольцо, а в центре находится центральная гранула (транспортер). К ней от периферийных гранул идут фибриллы. От цитоплазматического кольца в сторону цитоплазмы идут цитоплазматические филаменты. Между цитоплазматическим кольцом и внешней ядерной мембраной располагаются тонкое кольцо и звездчатое кольцо. Цитоплазматическое кольцо связано внутренними филаментами с транспортером, который находится в центре и заполняет пространство между внешней и внутренней ядерной мембраной. На внутренней мембране находится нуклеоплазматическое кольцо, от которого в сторону ядра направляются филаменты, образующие корзинкоподобную структуру, связанную терминальным кольцом. Внутри центральной гранулы находится канал - центральная пора, по которой обеспечивается транспорт веществ - внутреннее радиальное кольцо. Гранулы пор связаны с бел­ками ламины, участвующей в их организации. Комплекс пор содержит рецепторы, осуществляю­щие узнавание и транспорт веществ, поступающих в ядро (переносчики). 

Весь ЯПК закрепляется интегральными белками в стенке мембраны в том месте, где две мембраны ядерной оболочки переходят одна в другую. Размер ядерных пор и их структура одинаковы у всех эукариот, а число зависит от метаболической активности клеток; в среднем ядерная обо­лочка содержит 2000-4000 пор. Обмен макромолекул (белки и РНК) между ядром и цитоплазмой осуществляется через ядерные поры. Поры регулируют транспорт через ядерные мембраны. Пептиды и небольшие белки легко проникают в ядро. Более крупные белки (свыше 40 кДа) могут пройти через ядерную мембрану, только при наличии специфической сигнальной последовательности, которая ориентирует белок на ядро и состоит из 4 основных аминокислот (см. ниже). В отличие от других сигнальных последовательностей, они не расщепляются при переносе белка в ядро.

Рис. 170. Модель строения комплекса ядерной поры: А – по Клаг,2009; Б – по Karp, 1999, из: Величко,2008

Рис.171. Схема транспор- та крупных молекул в яд- ро через ЯПК:1–ядерный локализационный сигнал, 2 – белок, 3 – рецептор, взаимодействующий с бел- ком, 4 –5 - рецепторный комплекс, взаимодейст -вующий с ядерно-поровым комплексом(Из: Интернет- ресурсы – Ядро. Структура и функции)

Транспорт веществ из ядра и в него происходит путем активного транспорта, пассивной диф­фузии. Пассивная диффузия через ЯПК обеспечивает транспорт: мелких (<9кДа) молекул и ионов, которые диффундируют через водный канал ЯПК. Более крупные молекулы перемещаются путем активного транспорта с вовлечением ядерного сигнала и энергозависимого механизма (рис.171).

Активный транспорт осуществляется по следующей схеме:

1. Растворенный в цитозоле рецептор узнает импортированную молекулу. Белки, транспорти­руемые в ядро, несут ядерный локализационный сигнал (ЯЛС), которым является особая по­следовательность аминокислот (например, про-лиз - лиз - лиз - лиз - ала - лиз - вал - про). Ре­цептор и молекула белка связываются в комплекс. Этому способствуют особые белки импортины.

2.Рецепторный комплекс связывается с цитоплазматической поверхностью ядерно-порового комплекса (ЯПК).

3.Комплекс рецептор-белок перемещается к рецепторному каналу ЯПК. Энергия гидролиза ГТФ активизирует воротный механизм центральной поры, что приводит к проведению комплекса в кариоплазму, где комплекс распадается, а транспортные белки и рецептор возвращаются в цито­плазму.

Кариолемма выполняет следующие функции:

1 - защита ядра;

2 - разграничение содержимого ядра от цитоплаз­мы;

3 - регуляция транспорта веществ, в том числе рибосом, из ядра в клетку и наоборот.

Структурная целостность мембраны поддерживается слоем белков, называемым ядерным скелетом или матриксом.

Ядерный матрикс

Ядерный матрикс, белковый ядерный остов или ядерный скелет- это трехмерная сеть фибриллярных белков, опорная структура ядра клетки, которая обеспечивает:

- упорядочение процессов репликации и транскрипции хроматина;

- обособление хромосом при митозе;

- правильное расположение хромосом в интерфазном ядре.

Ядерный матрикс состоит из тяжей негистоновых белков, прони- зывающих ядро и ядерную ламину. Эта внутриядерная систем служит основой для всех ядерных компонентов: хроматина, ядрышка, ядерной оболочки.

Впервые компоненты ядерного матрикса (остаточные ядерные белки) были выделены и охарактеризованы в начале 1960-х годов. Было обнаружено, что если последовательно обработать изолированные ядра печени крыс специальным составом нуклеаз происходит полное растворение хроматина и вымывание липидов мембраны. Оставшаяся часть ядра составляет компоненты ядерного матрикса:

- 98% из негистоновых белков;

- 0,1% ДНК;

- 1,2% РНК;

- 1,1% фосфолипидов.

В середине 1970-х годов эти исследования получили развитие и привели к появлению новых сведений о нехроматиновых белках ядерного остова и его роли в физиологии клеточного ядра. Тогда же был предложен термин «ядерный матрикс» для обозначения остаточных структур ядра после экстракции ядер различными растворами.

Морфологически ядерный матрикс состоит из трех компонентов: периферического белкового сетчатого (фиброзного) слоя - ядерной ламины (nuclear lamina, fibrous lamina), внутренней, или интерхроматиновой, сети (остов) и «остаточного» ядрышка (рис.172).

Рис. 172. Ядерный белковый матрикс: а - схема строения ядер до экстракции; б - после экстракции;1 — примембранный белковый слой (ламина) и поровые комплексы; 2 - внутриядерный остов или интерхроматиновая сеть матрикса; 3 - белковый матрикс ядрышка – «остаточное» ядрышко

Ядерная ламина представляет собой тонкий фиброзный слой, подстилающий внутреннюю мембрану ядерной оболочки (см.ниже). Структурная функция ламины очень велика: она образует сплошной волокнистый белковый слой по периферии ядра, поддерживающий морфо- логическую целостность ядра.

Внутриядерный остов, или интерхроматиновая сеть представляет собой рыхлую волокнистую губчатую сеть, располагающуюся между участками хроматина.

«Остаточное» ядрышко - структура, состоящая из плотно уложен- ных белковых фибрилл, повторяющих по своей форме ядрышко.

Белковый состав ядерного матрикса разных клеток довольно бли - зок. Характерными для него являются:

- три белка фиброзного слоя, называемые ламинами;

- негистоновые белки с молекулярными массами от 11—13 до 200 кДа, принимающие участие в компактизации ДНК в интерфазном ядре при создании розетковидной, хромомерной формы упаковки хроматина;

- белки остова (скэффолд) метафазных хромосом.

ДНК (0.1%), входящая в состав ядерного матрикса, представлена участками молекулы устойчивыми к действию нуклеаз. Это прочные ДНК с белком, к которым относятся:

- участки прикрепления ДНК к ядерному матриксу, которые фиксируют положение хромосом в ядре. Фиксация обеспечивается путем закрепления определенных участков ДНК (центромер, теломер) на ламине;

- участки ДНК длиной около 50 т.н. п., ассоциированые с белками, при создании розеткоподобных структур хроматина;

- участки ДНК, связывающие её с ядерным матриксом: MAR-последовательности (matrix attachment regions) или SAR-последо- вательности (scaffold attachment regions);

Ядерный матрикс играет заметную роль в репликации ДНК. На ядерном матриксе происходят инициация и собственно репликация ДНК. Фракция ДНК, связанная с ядерным матриксом обогащена репли- кативными вилками. В составе белков ядерного матрикса обнаружены следующие ферменты: ДНК-полимераза α, ДНК-праймаза, ДНК-лигаза, ДНК-топоизомераза II - основные ферменты репликации ДНК, РНК-полимераза II – фермент, ответственный за синтез информационных РНК. Таким образом, ядерный матрикс выполняет структурную функцию в процессах репликации ДНК, синтезе, процессинге и транспорте РНК в ядре.

В состав ядерного матрикса входит около 1% РНК, куда относятся: гя-иРНК, рРНК, тРНК и малые ядерные рибонуклеопротеиды (мяРНП), кото- рые участвуют в созревании информационных РНК в процессе сплайсинга. Эти РНК-содержащие частицы, иногда называемые сплайсосомами, собраны в группы, или кластеры, связанные с белками ядерного матрикса.

Ядерная ламина (лат. lamina - пластинка) или периферическая плотная пластинка, расположена под внутренней мембраной кариолеммы. Ламина:

- определяет и поддерживает форму яд­ра;

- участвует в организации яде6рного порового комплекса;

- способствует упорядоченному расположению хроматина, заякори - вая его на ядерной оболочке;

- входит в состав ядерного матрикса.

Комплексы ядерных пор как бы вмурованы в фиброзный слой ламины. Эту часть ядра называют фракцией «поровый комплекс-ламина» (PCL). В ядрах ламина большей частью морфологически не выявляется, так как к ней тесно прилегает слой периферического хроматина. Лишь иногда ее удается наблюдать в виде относительно тонкого (10—20 нм) фиброзного слоя, располагающегося между внутренней мембраной ядерной оболочки и периферическим слоем хроматина (рис.167,168). Ламина сформирована белками промежуточных филаментов, называемых ламинами: ламины А, В и С с молекулярной массой 60-75 кДа. Эти три полипептида, путем димер-димерного взаимодействия укладываются в 10-нм структуры, которые соединяются со специфическими белками ядерной мембраны (рис.168) с помощью С-ламина. В-ламин связана с определен - ными участками хромосом, а ламин А осуществляет связь между С и В ламинами. Ламины А и С, близки друг к другу иммунологически и по пептидному составу. Ламин В отличается от них тем, что он является липопротеидом и, поэтому, более прочно связывается с ядерной мембраной. Ламин В остается в связи с мембранами даже во время митоза, тогда как ламины А и С освобождаются при разрушении фиброзного слоя и диффузно распределяются по клетке.

Белки ламины близки по своему аминокислотному составу виментиновым и цитокератиновым промежуточным микрофиламентам цитоскелета. Но, в отличие от них ламины при полимеризации не образуют нитчатых структур, а организуются в сети (рис.109). Такие сплошные решетчатые участки подстилают внутреннюю мембрану ядерной оболоч- ки. Они могут разбираться при фосфорилировании ламинов и вновь поли- меризоваться при их дефосфорилировании, что обеспечивает динамичность как этого слоя, так и всей ядерной оболочки.

Таким образом, ядерная ламина поддерживает ядерную мембрану и контактирует с хроматином и ядерными РНК: интегральные белки внутренней ядерной мембраны (LBR, LAR1 и 2, эмерин и др.) закрепляют ламины с помощью дополнительных белков (BAF, HP1) (рис.168). Эти же белки участвуют в связывании ядерной мембраны с хроматином. Структура ламин изменяется во время деления клетки: фосфорилирования серина ламин делает их растворимыми; дефосфорилирование восстанавливает их нерастворимость и облегчает восстановление ядерной ламины.

В процессе деления клетки ядерная оболочка претерпевает изменения: она разрушается при митозе и вновь возникает после его окончания (рис.173). В профазе митоза при спирализации хромосом ядерная оболочка теряет с ними связь и в ней появляются разрывы. Ядерная оболочка приобретает вид изолированных плоских цистерн. На этом этапе ядерные поры еще видны, а позднее они исчезают, так как комплекс ядерной поры с молекулярной массой 120 кДа распадается на субкомплексы с массой примерно по 1 кДа. Ядерная оболочка превращается в мелкие мембранные пузырьки в зоне бывшего интерфазного ядра. Такие пузырьки сливаются с вакуолями эндоплазматической сети.

В конце митоза, в анафазе пузырьки, отпочковывающиеся от мембраны гранулярной эндоплазматической сети, собираются вокруг хромосом, становясь первичными зачатками ядерной оболочки. Мелкие пузырьки превращаются в плоские вакуоли, растут в ширину, окружают хромосомы, сливаются, замыкая и отгораживая новое интерфазное ядро от цитоплазмы.

Ламины деполимеризуется одновременно с распадом ядерных мембран и конденсацией хроматина. Сначала они деполимеризуются до димеров и тетрамеров, переходят в растворимое состояние, а затем равномерно распределяются в цитоплазме. Ламин В остается связанным с мембранными пузырьками, возникшими из ядерной оболочки. При реконструкции ядерной оболочки в телофазе ламины появляются в центромерных и теломерных участках хромосом.

Ядерные поры начинают появляться в самом начале восстановления ядерной оболочки. Сборка ядерных пор начинается с образования углубления при слиянии внешней и внутренней ядерной мембраны. Затем оно превращается в отверстие. Интегральные белки gp 210 и РОМ 121 впоследствии закрепят ЯПК на мембранах. После появления отверстия в ядерной оболочке образуются внутренние структуры ЯПК: комплекс кольца, спиц, добавление звездчатого кольца и других структур.

Рис.173. Состояние ядерной оболочки при митозе: 1 – интерфаза, 2,3,4 –

профаза, 5 – метафаза,6 – анафаза,7 – телофаза, 8 – реконструкция

дочерних ядер ( Из: Зацепин и др., 1976)

- 3.3. Ядрышко

Это плотный структурный компонент ядра, представляющий глобулу размером от 1 до 3 мкм, не имеющий оболочки и сильно преломляющий свет (рис.174-А).

Рис.174. Модель ядрышка (А); микрофотография ядрышка (Б) : 1 – фибриллярная и 2 – гранулярная части ядрышка (Из: Мяделец, 2002; Фаллер, Шилдс, 2004)

Ядрышко неоднородно по своему строению: оно со­стоит (по данным электронной микроскопии) из трех частей: фибриллярной (здесь находятся пер­вичные цепи рРНК), гранулярной (созревающие субъединицы рибосом) и аморфной (собственно ядрышковый организатор) (рис.174-Б). Диаметр гранул состовляет около 15—20 нм, толщина фибрилл – 6-8 нм. Фибриллярная часть ядрышка сосредоточена в центральной части ядрышка, а гранулярная - по периферии. В зоне фибрилл выявляются участки ДНК ядрышковых организаторов. При высоком уровне синтеза рРНК в яд - рышке выявляется большое число гранул, при прекращении синтеза количество гранул снижается, ядрышки превращаются в плотные фибриллярные тельца.

Ядрышко является производным хромосомы и образовано участками вторичных перетяжек 13-й, 14-й,15-й, 21-й и 22-й пары хромосом, в которых локализованы гены рибосомальных РНК (рис.175-А). Эти участки называются ядрышковые организаторы, и с них транск- рибируются ДНК и синтезируются рРНК. Количество ядрышек в клетках может изменяться за счет слияния ядрышек или за счет изменения числа хромосом с ядрышковыми организаторами.

Рис.175. Схема образования ядрышка (а) и его изменения в процессе митоза (б)

(Из: Альбертс и др.,1987)

Под действием некоторых веществ (актиномицин, митомицин, ряд канцерогенных углеводородов, циклогексимид и др.) вызывает в клетках изменение активности процессов синтеза рРНК и активности ядрышек. Это приводит к изменениям в структуре ядрышек: они сжимаются, происходит обособление фибриллярных и гранулярных зон, либо потеря гранулярной части, либо распад всей структуры.

Размеры и количество ядрышек зависит от функциональной активности клетки. Во время ми­тоза ядрышко исчезает, так как хромосомы спирализуются и расходятся к полюсам; синтез рРНК прекращает­ся и ядрышко распадается на 10 частей (по числу хромосом, его образующих), которые постепен­но исчезают. После митоза ядрышко вновь восстанавливается (рис.175-Б).

Функции ядрышка: синтез рРНК и образование рибосомных субъединиц. В результате транскрипции ДНК первоначально образуется гигантская молекула пре-рРНК, состоящая из 18S-рРНК, 5,8S-рРНК, 28S-рРНК, которая подвергается сплайсингу, процессингу и моди­фикации, в результате чего образуются молекулы 18S-рРНК, 5,8S-рРНК, 28S-рРНК (5S-рРНК синтезируется отдельно). Эти молекулы связываются со высокоспецифическими молекулами рибосомальных белков, синтезированных в цитоплазме и поступивших в ядро. Образуются рибонуклеопротеиды, в которых белки располагаются преимущественно на концах рибонуклеопротеидных тяжей. Затем рибонуклеопротеидные тяжи сворачиваются в глобулы наподобие глобул белков за счет сил ионного притяжения активных групп молекул белков, входящих в состав этого тяжа. Компактизации рибонуклеопротеидного тяжа способствуют высокая температура и присутствие ионов Mg²⁺. Глобулы, содержащие разные виды рРНК соединяются с добавочными рибосомальными белками и агрегируют друг с другом, образуя малую и большую субъединицы рибосом.