Cl. perfringens — короткая, спорообразующая, неподвижная, грамположительная палочка, анаэроб. Существуют 6 типов Cl. perfringens, обозначаемых начальными буквами латинского алфавита. Некоторые представители этих типов могут быть патогенными. Типы В, С, D, E являются возбудителями энтеротоксемии различных животных, а тип С также и возбудителем некротического энтерита людей.

В отличие от ботулизма пищевые заболевания, связанные с заражением продуктов Cl. perfringens, по-видимому, следует отнести к токсикоинфекциям.

Для бактериоскопии готовят 2—5 мазков-отпечатков Из каждой присланной пробы и окрашивают по Граму Или метиленовой синью, а при необходимости — на споры или капсулы. При микроскопировании обращают внимание на форму, наличие спор и капсул и расположение отдельных микроорганизмов.

Для посева на питательные среды пробы обжигают и навеску массой около 10 г растирают в стерильной ступке с физиологическим раствором в соотношении 1 : 2.

По 3—5 мл приготовленной взвеси засевают в четыре большие пробирки с мясной средой типа Тароцци, залитой слоем вазелинового масла толщиной 0,5 см, предварительно прогретой в кипящей водяной бане в течение 20—30 мин., а затем быстро охлажденной до температуры не ниже 50 °С. Посевы перед термостатированием прогревают при температуре 80°С в течение 20 мин. (две пробирки); при исследовании на Cl. botulinum типа Е одну пробирку прогревают при температуре 60 °С в течение 15 мин. (при этом сохраняются споры Cl. botulinum E), а другую при 80 °С в течение 20 мин. Остальные пробирки оставляют непрогретыми.

При подозрении на Cl. botulinum для выявления типа Е пробирки — одну непрогретую и одну прогретую до 60 °С — выдерживают при температуре 28°С.

Другие пробирки (непрогретую и прогретую при 80 °С) инкубируют при температуре 37 °С для выявления остальных анаэробов.

Термостатирование проводят в течение 5—10 сут.; наблюдают за ростом ежедневно. При обнаружении роста осуществляют микроскопическое исследование.

Для биологической пробы можно использовать присланный материал, а также чистую культуру. При подозрении на ботулизм биопробу ставят на белых мышах (реакция нейтрализации токсина противоботулинической сывороткой). Для этого исходный материал растирают в ступке со стерильным физиологическим раствором в соотношении 1 :2, для экстрагирования токсина выдерживают 1 —1,5 ч при комнатной температуре, а затем фильтруют через ватно-марлевый фильтр или центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15—20 мин.

Далее проводят реакцию нейтрализации токсина; к 0,5—0,8 мл фильтрата (центрифугата) добавляют 0,24 мл смеси диагностических, моновалентных, противоботулинических сывороток типа А, В, С, D, E, F (по 0,04 мл каждого типа).

Двум мышам вводят внутривенно или внутрибрюшинно по 0,5—0,8 мл исследуемого фильтрата. Центрифугат вводят в такой же дозе только внутривенно. Другим двум мышам вводят смесь фильтрата (центрифугата) и сыворотки, где токсин находится в нейтрализованном состоянии (контроль).

Аналогичный эксперимент можно провести с 6—7-месячной культурой, выращенной на печеночном бульоне. Пастеровской пипеткой отсасывают верхний слой культуры, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и вводят белым мышам в той же дозе.

Если при введении необработанного противоботулинической сывороткой фильтрата мыши погибли, биопроба считается положительной, то есть в исследуемом материале имеется токсин. Мыши, которым вводили смесь фильтрата (центрифугата) с сывороткой, выживают.

В случае гибели всех четырех мышей повторяют реакцию нейтрализации токсина в фильтрате (центрифугате) в разведении в 5, 10, 20 и более раз и вновь ставят биопробу.

При обнаружении в присланных пробах ботулинического токсина сразу же ставят развернутую реакцию нейтрализации с типоспецифическими диагностическими сыворотками для определения типа токсина.

При подозрении на энтеротоксемию овец и дизентерию ягнят взвесь в дозе 0,5—1 мл вводят внутримышечно кроликам или морским свинкам (гибель в течение суток); при подозрении на некробактериоз заражают подкожно кролика в область уха или мышь в область живота (появляются некрозы); при подозрении на столбняк — вводят подкожно фильтрат из культуры в дозе 0,5—0,8 мл белым мышам в область корня хвоста (погибают на третьи- четвертые сутки); при подозрении на эмкар — заражают внутримышечно взвесью в дозе 0,5—1 мл морскую свинку (погибает через 16—96 ч.); при подозрении на злокачественный отек — вводят внутримышечно взвесь. в дозе 1 мл морской свинке или мышке (погибают через 12—24 ч.); при подозрении на брадзот овец заражают взвесью подкожно или внутримышечно морскую свинку в дозе 1 мл (погибает через одни-двое суток).

Микобактерии — это микроорганизмы, обладающие способностью при культивировании на питательных средах образовывать длинные нити со вздутиями на концах, и виде колбочек. Под микроскопом они похожи на мицелий плесневых грибов. Среди микобактерий различают патогенные виды и сапрофиты. Последние широко распространены в природе.

Патогенные микобактерии — возбудители ряда инфекционных заболеваний животных и человека. Они вызывают туберкулез многих видов сельскохозяйственных животных, а также паратуберкулез крупного рогатого скота.

Обнаружение возбудителя туберкулеза. Существует пять видов микобактерий туберкулеза: М. tuberculosis, М. bovis, M. avium, M. murium,

M. poykilothermorum. Сущность метода выявления этих микроорганизмов и их видовая типизация заключается в определении по мор фологии, скорости и характеру роста на питательных средах, по патогенности и другим свойствам. Микобактерии туберкулеза — тонкие, прямые или слегка изогнутые палочки с закругленными краями. Располагаются изолированно или группами. Спор и капсул не образуют, неподвижны, кислото- и спиртоустойчивы.

Ввиду гидрофобности оболочек грамокраску микобактерий проводят модифицированным методом (по Грам — Мухе). Вначале мазок окрашивают карболовым метилвиолетом с подогреванием до появления паров, затем Краску сливают, а мазок обрабатывают раствором Люголя с последующим обесцвечиванием поочередно 5%-ной азотной кислотой, 3 %-ной соляной кислотой и смесью ацетона и алкоголя. Дополнительно препарат окрашивают сафранином или разведенным фуксином. При микроскопии на красном фоне видны фиолетовые микобактерии.

Влаборатории из присланного материала (кусочки печени, селезенки, легких

илимфоузлов) делают мазки, фиксируют их на пламени и окрашивают по Цилю— Нильсену. Микобактерии можно обнаружить не в каждом случае, поэтому просматривают 100—200 полей зрения. Для бактериоскопического исследования применяют люминесцентный анализ: простое флуорохромирование или иммунофлуоресцентный метод.

Если в исследуемом материале туберкулезных микобактерий слишком мало, то прибегают к обогащению — центрифугированию или флотации. Для этого материал измельчают, растирают в ступке, заливают 1 %-ным раствором едкого натра, размешивают и переносят в колбу, которую встряхивают 10—15 мин. Затем содержимое центрифугируют 10 мин., надосадочную жидкость сливают, осадок нейтрализуют кислотой и из него делают мазки.

Метод флотации основан на адсорбции углеводородами (ксилолом, бензином, лигроином) микобактерий туберкулеза и всплывании последних вместе с ними. Этот метод применяют при исследовании молока и мокроты, реже — бронхиальной слизи, экссудата, суспензий из растертых органов и тканей.

Питательные среды для культивирования микобактерий делят на: глицериносодержащие (простые) и элективные (белковые и безбелковые). К первым относят глицериновый мясо-пептонный бульон и агар, а также глицериновый картофель. Ко вторым относят среды: Петраньяни, Гельберга, Левенштейна — Йенсена, а так же безбелковые среды: Сотона, Моделя и др.

Для получения культур микобактерий туберкулеза материал перед посевом обрабатывают по методу Л, П. Аликаевой или Гона. По методу А. П. Аликаевой, материал разрезают на кусочки размером 0,5 см2, помещают

в ступку и заливают 3—6 %-ным раствором серной кислоты на 10—20 мин. Затем кусочки тканей промывают 5 мин физиологическим раствором и растирают. Из полученной суспензии делают посевы и готовят мазки.

На жидких питательных средах с глицерином рост микобактерий туберкулеза проявляется в виде пленки только через 30—30 сут., а иногда и позже.

На плотных питательных средах они образуют вначале едва заметные микроколонии, которые затем увеличиваются и приобретают различные размеры. Они могут быть мелкими, крупными, блестящими или матовыми, гладкими или шероховатыми. Располагаются колонии единично, однако может быть и сплошной рост.

Для биологического исследования используют тот же материал, который был приготовлен для посева на питательные среды, а серную кислоту, находящуюся в нем, необходимо нейтрализовать стерильным 10 %-ным раствором двууглекислой соды. Заражают кроликов, морских свинок, а при необходимости и кур. Биопроба наряду с бактериоскопическим, культуральным и биохимическим методами позволяет определить вид микобактерий туберкулеза.