Колонии, подозрительные на Вас. anthracis, отвивают на
поверхность скошенного МПА и МПБ для получения чистой культуры, которую используют в дальнейшем для определения видовой принадлежности выделенного микроба. Для этого производят высев на цветной ряд, состоящий из следующих сред: МПБ, МПА, МПЖ, молока, агара или бульона с кровью, ставят биологическую пробу на опытных животных, реакцию преципитации.
Обнаружение бацилл сибирской язвы. Сущность метода выявления бацилл сибирской язвы заключается в определении их характерной морфологии и характера роста на питательных средах, а также изучение патогенности заражением лабораторных животных (белых мышей).
Бациллы сибирской язвы неподвижны, в организме образуют капсулы, а во внешней среде при доступе кислорода и температуре 12— 42 °С — споры. При микроскопии мазков из патологического материала обнаруживают крупные грамположительные палочки, соединенные в короткие цепочки, а иногда цепочки имеют форму бамбуковой трости.
При окраске 2 %-ным раствором сафранина сибиреязвенные бациллы окрашиваются в кирпично-красный цвет, а капсулы и теки (следы распада бактерий) — в светло-желтый.
При окраске раствором Ребигера бациллы антракса окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, а капсулы — в красно-фиолетовый.
На МПА через 16—24 ч бациллы растут в виде серо-белых, шероховатых с бахромчатыми краями колоний, напоминающих при осмотре с лупой «головку медузы» Или «львиную гриву». Из подозрительной колонии делают посев в пробирку с МПБ.
Рост Вас. Anthracis на кровяном МПА
Мазок из чистой культуры Вас. Anthracis (РИФ)
Споры Вас. Anthracis, окраска по Ауеске
На МПБ сибиреязвенные бациллы растут в виде крупных хлопьев, оседающих на дно пробирки к концу первых суток, с образованием осадка, напоминающего комок ваты. Бульон остается прозрачным. Из бульонной культуры готовят препарат «раздавленная» или «висячая» капля. При микроскопии препарата под средним увеличением микроскопа обнаруживают неподвижные сибиреязвенные палочки.
Иногда возникает необходимость дифференцировать сибиреязвенные бациллы от сапрофитных бацилл, которые морфологически очень сходны. В этом случае чистую культуру, выросшую на МПА или МПБ, исследуют: на капсулообразование in vitro, на гемолитическую активность, на тест «жемчужное ожерелье», на чувствительность к сибиреязвенному фагу или на свертываемость желтка куриного яйца.
Для возбудителя сибирской язвы в отличие от сапрофитных бацилл характерно отсутствие гемолиза как вокруг колоний на МПА, так и в МПБ с кровью.
Из исследуемого материала готовят взвесь на физиологическом растворе. 0,5 мл этой взвеси вводят двум белым мышам подкожно в область спины. При исследовании материала от свиней (подчелюстные лимфатические узлы) опытных животных заражают молодой (16-часового роста) чистой культурой. После гибели мышей, которая наступает через 24—72 ч., их вскрывают; из крови сердца, печени, селезенки и места заражения готовят мазки и производят посевы на питательные среды (МПА, МПБ). Одновременно с бактериоскопией исходного материала в сомнительных случаях проводят реакцию преципитации (РП).
2 г исследуемого материала мелко нарезают, помещают в пробирку и заливают 10 мл карболинизированного 0,5%-ного физиологического раствора. Если исследуют свежий материал, то его предварительно выдерживают в термостате при 37°С в течение 18—24 ч. Полученный экстракт кипятят 30—40 мин. и фильтруют через асбестовую нейтральную вату до полной прозрачности. Прозрачный экстракт в количестве 0,25—0,3 мл вносят в узкую пробирку и под него подслаивают такое же количество преципитирующей сибиреязвенной сыворотки, профильтрованной через бумажный фильтр. В случае положительной реакции через 3—8 мин. на границе сыворотки и экстракта появляется преципитирующее кольцо; при сомнительной реакции оно появляется через 10—15 мин.; при отрицательной— кольцо отсутствует. При проведении РП контролем служат стандартный сибиреязвенный антиген и стандартная сибиреязвенная сыворотка, нормальная сыворотка с исследуемым экстрактом, преципитирующая сыворотка с физиологическим раствором. В первой контрольной пробирке должно образоваться кольцо, а в двух других — нет, т. е. реакция отрицательная.
Основанием для постановки диагноза на сибирскую язву являются наличие капсул в мазках из органов, а в мазках из культуры — грамположительных палочек, расположенных в виде цепочек; концы палочек, обращенные друг к другу, резко обрублены; характерный рост на МПА, МПБ, МПЖ; положительная РП и положительный результат биологической пробы.
При бактериологическом исследовании на сибирскую язву, особенно несвежего материала, часто обнаруживают большое количество посторонней микрофлоры. В этом случае трудно дифференцировать Вас. anthracis от антракоидов, псевдоантраксных палочек и других спорообразующих сапрофитных аэробов, положительно красящихся по Граму и имеющим колонии, сходные с колониями сибиреязвенного микроба.
Для дифференциации необходимо сделать посевы на МПБ с кровью, МПЖ и исследовать культуру микроорганизма на подвижность. Для ускоренной дифференциальной диагностики возбудителя сибирской язвы и сходных с ним почвенных аэробных бацилл рекомендуется использовать следующие тесты: феномен «жемчужное ожерелье», чувствительность к сибиреязвенному бактериофагу, свертываемость желтка куриного яйца, гемолитическую активность, феномен капсулообразования.