Работа № 8 определение витамина в2 (рибофламина) в драже или таблетках флуориметрическим методом.
Витамин В2, рибофлавин, содержится в мясе, рыбе, печени, молоке, яичном желтке и в растительных продуктах.
В организме человека витамин В2 участвует в углеводном и жировом обмене.
В аналитической химии используют рибофлавин в качестве абсорбционного флуоресцентного индикатора, наряду с эозином и флуоресцеином.
При восстановлении раствора рибофлавина гидросульфитом натрия происходит химическое гашение флуоресценции из – за превращения рибофлавина в бесцветное соединение.
Гашение флуоресценции при восстановлении рибофлавина используется при анализе его растворов, содержащих флуоресцеирующие примеси. Вначале измеряют суммарную интенсивность флуоресценции раствора, и после гашения свечения рибофлавина восстановлением NaHSO3 измеряют остаточное свечение примесей; по разности общего и остаточного свечения определяют свечение рибофлавина.
Количественное определение витамина В2 заключается в построении с помощью стандартных растворов градуировочной кривой в координатах: содержание рибофлавина в мкг (ось абсцисс) - интенсивность флуоресценции (ось ординат).
После определения по графику содержания рибофлавина в исследуемом растворе его проверяют на присутствие примесей путем гашения свечения рибофлавина гидросульфитом натрия и измерение остаточной флуоресценции.
Y
С
Используемый в Концентрационное гаше -
анализе диапазон ние
флуоресценции
концентраций (при больших
концентрациях)
от
10-4
до 10-7
Рис. 14
Кривая зависимости интенсивности
флуоресценции от концентрации вещества.
Выполнение работы Построение градуировочной кривой Приготовление стандартных растворов
1.Отбирают мерной пипеткой 20 см3 раствора №1, содержащего 20 мкг рибофлавина в 1 см3, помещают в мерную колбу на 100 см3, доводят дистиллированной водой до метки, закрывают пробкой и перемешивают. Исходный раствор №2 содержит 4 мкг/см3 рибофлавина.
Для приготовления стандартных растворов в 4 мерные колбы на 100 см3 бюреткой отмеривают порции раствора №2 и доводят до метки дистиллированной водой:
№ колбы |
Раствор в см3 |
Содержание рибофлавина в мкг/см3 |
1 |
5,0 |
0,2 |
2 |
10,0 |
0,4 |
3 |
15,0 |
0,6 |
4 |
20,0 |
0,8 |
5 контрольный раствор |
х |
х выдает преподаватель |
3. Растворы перемешивают, переливают в измерительные пробирки и ставят в гнезде ящика для защиты от света.
4. Приготовляют раствор рибофлавина из таблетки, полученной от лаборанта. Для этого помещают таблетку в мерную колбу на 100 см3,добавляют горячей (70- 80°C) дистиллированной воды до 2/3 объема и растворяют таблетку. Охлаждают колбу до комнатной температуры и заполняют дистиллированной водой до метки, закрывают пробкой и перемешивают. Отбирают пипеткой 3 см3 этого раствора в мерную колбу на 100 см3 №6, добавляют дистиллированной воды до метки и перемешивают. Из колбы №6 раствор переливают в пробирку №6 и ставят в гнездо ящика.
Измерение флуоресценции на флуориметре ЭФ – ЗМА
1. Помещают в измерительную камеру пробирку с раствором IV. Проверяют настройку на нуль и нажав клавишу заслонки, устанавливают рукояткой стрелку на 80 делений.
2. Вынимают пробирку IV и, последовательно помещая в камеру пробирки I, II, III, IV, V и VII, измеряют интенсивность их лиминисценции дважды. Флуориметр должен работать не более 30 минут, после чего его выключают для охлаждения.
3. По величинам интенсивности стандартных растворов I, II, III, IV строят градуировочный график, имеющий прямолинейный характер.
4. Используя его определяют содержание рибофлавина в контрольном растворе (пробирка V). При удовлетворительных результатах (ошибка не должна превышать 2-3%) приступают к определению его в таблетках.
5. Проводят гашение люминесценции рибофлавина, предварительно повторив измерение растворов VI и VII. Для гашения восстанавливают рибофлавин гидросульфитом натрия. Добавляют в пробирки по 0,5 г гидросульфита, закрывают пробкой и перемешивают 30 сек.
6. Проверяют настройку прибора по стандартному раствору IV и снова измеряют свечение в прбирках VI и VII. Если стрелка прибора отклонилась на 0,5-1 деление, считают полученную ранее величину интенсивности правильной. При значительном отклонении стрелки его учитывают при содержании вещества.