Практическая работа № 4 (6 ч) Методы и техника культивирования микроорганизмов на питательных средах
Цель: Изучить способы посевов и пересевов микроорганизмов на питательные среды. Произвести посев смеси микробных культур на чашки Петри с МПА. Ознакомиться с аппаратом для культивирования микроорганизмов (термостат).
Оборудование и материалы: чашки Петри стерильные, завернутые в бумагу; материал для посева (2 колбы); МПА расплавленный, МПБ; стерильные пипетки; бактериологические петли и иглы; карандаши или чернила по стеклу; спиртовые горелки; спички.
Способы посева и пересевов микроорганизмов на питательные среды
Размножение микроорганизмов осуществляется на питательных средах. Посев культуры микробов, на такие среды проводят бактериологической петлей или иглой (рис.1), а также пипетками Пастера или Мора.
Перед употреблением пипетки стерилизуют в автоклаве. Тонкие концы пастеровских пипеток должны быть запаяны. Внутрь широкого конца пипетки, с которым соприкасаются губы исследователя, вставляют кусочек стерильной ваты, препятствующий попаданию материала в ротовую полость. Пипетки хранят в специальных пеналах или завернутыми в бумагу, в которой они стерилизовались. Бумагу открывают со стороны запаянных концов.
Петлю или пипетку держат в правой руке, пробирку в левой. Пробку прижимают мизинцем правой руки к ладони и после извлечения держат в руке. Петлю вводят в пробирку, материал на плотной среде распределяют зигзагообразно (рис.2), а в жидкой – вращательными движениями. При пересеве из одной пробирки в другую, петлю, после введения внутрь, охлаждают, затем соприкасаются с культурой и выносят из пробирки так, чтобы она не прошла над пламенем горелки. Если петля сделана из вольфрамовой или другой медленной охлаждающейся проволоки, лучше вначале касаться стерильной среды, а затем культуры. Тонкий слой среды на петле не только охлаждает ее, но и предохраняет культуру от гибели.
Для посева в пробирки с МПА столбиком необходимо иметь бактериологическую иглу, которая беспрепятственно проходила бы в глубь плотной питательной среды. На пути прохождения иглы остаются микробы, они могут расти по уколу. При посеве бульонной культуры петлю погружают до дна пробирки, а затем поступают так же, как и при посеве на плотную питательную среду.
Пастеровскими пипетками берут жидкий материал или культуру, выращенную на той же среде. Перед взятием материала пипетку проводят над пламенем горелки, стерильным пинцетом отламывают запаянный конец, набирают материал и переносят на питательную среду. Пробирку закрывают над пламенем, а пипетку опускают в сосуд с дезинфицирующей жидкостью. На пробирках или чашках пишут дату, название культуры, номер экспертизы, а при проведении научных исследований делают и другие пометки, после чего ставят в термостат для культивирования (для патогенных микроорганизмов обычно при 370С).
Для выделения из микробной смеси или материала чистой культуры готовят разведения на физиологическом растворе и только после этого делают посев на плотную питательную среду в микробиологические чашки. Петлей или пипеткой на плотную питательную среду в чашке наносят капельку смеси и легкими движениями шпателем распределяют ее по всей поверхности. Для того, чтобы получить изолированные колонии, необходимо внесенную каплю распределить на поверхности среды в нескольких чашках, перенося шпатель из первой во вторую, из второй в третью и т.д.
Шпатель обычно делают из стеклянной палочки в виде треугольника на одном конце или металлический из тонкой проволоки. Лучше первый, так как при распределении смеси он легко скользит по поверхности среды. Крышку чашки во время посева открывают по направлению к пламени горелки. По окончании посева шпатель фламбируют и ставят в штатив. Чашки переворачивают вверх дном и ставят в термостат. В перевернутом положении исключается возможность слияния колоний, при небольшом количестве они будут находиться на некотором расстоянии, изолированно.
В чашки Петри вносят питательную среду, для чего МПА столбиком
расплавляют на водяной бане. Содержимое пробирок выливают над пламенем горелки и плавными вращательными движениями равномерно распределяют по поверхности чашки дна чашки.
Первый студент делает посев на одну чашку, которую со стороны дна делит на три сектора и соответственно обозначает цифрами I, II, III (рис.3). В первый сектор петлей вносят каплю культуры. Шпателем смесь вначале распределяют в этом секторе, затем переносят его во второй и третий. Второй студент делает посев на две чашки (рис. 3). Микробную смесь вначале вносят в первую чашку, которую распределяют шпателем и этот же шпатель переносят во вторую чашку. Все чашки переворачивают вверх дном и ставят в термостат. Таким путем осуществляется получение изолированных колоний и выделение культуры в чистом виде.
Термостат
Выращивание микроорганизмов на естественных и искусственных средах проводят при оптимальной температуре. Это одно из основных условий получения культуры с определенными свойствами и в достаточном количестве. Создать постоянную температуру в течение длительного времени можно в специальных аппаратах, называемых термостатами. Существует много форм и конструкций таких аппаратов. Они могут быть водяного и воздушного обогрева. В современных термостатах источником тепла является электричество. Широкое распространение получили суховоздушные электрические термостаты с терморегулирующим устройством повышенной точности.
Такие аппараты состоят из корпуса, рабочей камеры, электромонтажного блока, который осуществляет автоматическое терморегулирование, и подставки. Корпус термостата имеет двойные стенки, между которыми циркулирует теплый воздух, выделяемый электронагревателем, расположенным в нижней части средней камеры. Средняя камера от наружной стенки отделена теплоизоляционным материалом. Термостат имеет две двери: внутреннюю – стеклянную и двойную – наружную, заполненную теплоизоляционным материалом. В рабочей камере термостата находятся три перфорированные съемные полки, выполненные из листов полированной латуни, которые могут быть установлены на разную высоту.
В верхней части корпуса помещается контрольный термометр. На панели электромонтажного блока расположен тумблер включения и выключения сети, сигнальные лампы, кнопка подсвета термометра, ручки настройки терморегулирующего устройства. При его установке термостат должен быть заземлен. Включение аппарата в сеть без заземления запрещено!