ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

"ТВЕРСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ"

Кафедра «Биотехнология и химия»

Основы общей микробиологии и

cанитарно- микробиологический контроль

объектов окружающей среды

(Методические указания к лабораторному практикуму)

Тверь- 2006

УДК 576.8: 614.31 (075.8)

ББК 28.4, 51.21, 51.23

Составитель: д.б.н., профессор Г.Ю. Рабинович

Методические указания «Основы общей микробиологии и cанитарно-микробиологический контроль объектов окружающей среды» подготовлены в соответствии с программой дисциплины «Санитарно-микробиологический контроль» и основываются на методических разработках, являющихся общепринятыми при обучении студентов общей и специальной микробиологии. Методические указания позволяют получить практические навыки при освоении вопросов общей микробиологии и санитарно-микробиологического контроля объектов биосферы – почвы, воды, воздуха.

Методические указания предназначены для студентов кафедры биотехнологии и химии Тверского государственного технического университета, обучающихся по выше названной дисциплине специализации в рамках подготовки специалистов по направлению 653800 – Стандартизация, сертификация и метрология, по специальности 200503 – Стандартизация и сертификация.

Методические указания рассмотрены и одобрены на заседании кафедры биотехнологии и химии Тверского государственного технического университета.

Протокол № 1 от 4.09.06 г.

© Тверской государственный

техниченский университет, 2006

© Рабинович Г.Ю.

Практическая работа № 1 (4 ч) Микробиологическая лаборатория. Микроскопический метод

Цель: ознакомиться с микробиологической лабораторией, правилами и техникой безопасности при работе в ней. Изучить устройство микроскопа, а также особенности работы с иммерсионной системой.

Оборудование и материалы: штативы, пробирки, бактериологические петли, пастеровские пипетки и пипетки Мора, краски, капельницы с растворами красок, песочные часы, колбы с дистиллированной водой для смыва краски с мазков, банки с растворами для отработанных предметных и покровных стекол, микроскопы, марлевые салфетки для снятия пыли и протирания сухих систем, фланелевые салфетки для снятия масла с иммерсионного (x90) объектива, иммерсионное масло (кедровое и его заменители), настольное освещение.

Микробиологическая лаборатория.

Лаборатория планируется таким образом, чтобы в большинстве помещений было хорошее освещение. Желательно, чтобы окна были направлены на северо-запад, северо-восток или север. При расположении окон на юг в ясные солнечные дни их лучше завешивать белыми шторами, чтобы лучи солнца не попадали в поле зрения микроскопа. В лаборатории должны быть водопровод, канализация и по возможности газ. Стены прямые, без выступов, закруглены у потолка, покрашены светлой масляной краской или облицованы пластиком. У выхода из помещения монтируют раковину, здесь же находится бутыль с дезинфицирующим раствором, мыло и полотенце. Пол покрывают линолеумом, так как в щелях между досками может накапливаться грязь, а следовательно, и всевозможная микрофлора.

Столы для работы располагают у окон так, чтобы было максимум света и удобств. При небольшом количестве окон в лаборатории (помещении) для занятий со студентами можно использовать столы трапециевидной формы. Такие столы ставят перпендикулярно к окну. Края столов скошены под углом 70-80⁰, что дает возможность сидящим дальше от окна беспрепятственно пользоваться светом. Столы покрывают пластиком, плексигласом или стеклом. Вдоль стола, посередине, ставят штативы для пробирок, флаконы или капельницы с красками в штативах колодках, спиртовки и газовые горелки. По этому же ряду монтируют освещение, которое должно приближаться к естественному или быть матовым.

Для обеспечения микробиологических исследований надо иметь культуры микроорганизмов, аппаратуру, подсобные помещения: моечную, автоклавную, средоварочную, бокс, препараторскую, термостатную, комнату для оборудования, виварий для содержания подопытных животных.

Моечная должна иметь столы, раковины, электрические или газовые плиты; сушильный, вытяжной и другие шкафы.

Необходимость вытяжного шкафа связана с появлением паров воды, а также некоторых реактивов, используемых при мойке стекол и посуды. Пол и стены облицованы плиткой.

Автоклавная – комната для стерилизации. В ней находятся один-два автоклава и стол. В автоклавной должна быть хорошая вентиляция для удаления остатков пара, выходящего после открывания автоклава. Пар из автоклава, до подъема давления, выводится через резиновую трубку в ведро с водой.

Средоварочная – комната для приготовления питательных сред. Стены такой комнаты облицованы плиткой или покрашены масляной краской. Пол выстлан плиткой или покрыт линолеумом. В средоварочной необходимы: столы, электроплитки, ящики с отсеками для сред в пробирках, шкаф для хранения химреактивов и других компонентов питательных сред. Здесь же может находиться и автоклав.

Термостатная – имеет термостаты разных форм и размеров, отрегулированные на разные температуры.

Препараторская – место работы обслуживающего персонала и подготовки оснащения к проведению микробиологического анализа.

Бокс-комната используется для пересева культур микроорганизмов и проведения научно-исследовательской работы, которая требует стерильных условий. Бокс должен быть остеклен, стекла хорошо промазаны, чтобы не проникал из окружающей среды воздух, а вместе с ним и микроорганизмы. Стерилизация бокса может проводиться разными путями, желательно, чтобы в нем была бактерицидная лампа.

Виварий – помещение, где содержат белых мышей, белых крыс, морских свинок, кроликов и других лабораторных животных. Таких животных чаще используют в научно-исследовательской работе, реже на занятиях, поэтому там, где нет условий, виварий часто отсутствует.

Реактивы и некоторые биологические препараты хранят в подвале или в темном стенном шкафу, где сухо, температура невысокая и без резких колебаний в течение года.

Правила и техника безопасности для студентов при работе

в микробиологической лаборатории.

1. Заходить и работать в микробиологической лаборатории только в халате.

2. Не вносить посторонних вещей.

3. Работать на одном и том же месте и пользоваться закрепленным оборудованием.

4. Соблюдать чистоту и опрятность при работе.

5. Во избежание заражения во время перерывов не курить и не принимать пищу.

6. На столе должно быть только необходимое для выполнения работы.

7. По окончании работ необходимо привести в порядок рабочее место и оборудование.

8. Во избежание взрыва не зажигать одну спиртовку от другой, использовать для этой цели спички, зажигалку.

9. Не соприкасаться с металлическими и другими предметами с проводами и контактными частями электросети.

10. Без ведома преподавателя или обслуживающего персонала не включать электроприборы и аппаратуру.

11. Соблюдать правила обращения с химическими и другими реактивами.

12. Уходя из лаборатории, тщательно вымыть руки.

Микроскоп и микроскопирование.

Микроскоп – оптический прибор для изучения микрообъектов. Студенческие лаборатории чаще оснащены биологическими микроскопами МБИ-1 и др. В микроскопе различают механическую и оптическую части.

Механическая часть включает штатив, предметный столик и тубус. Штатив обычно цельнометаллический или пластмассовый с подковообразной ножкой, что обеспечивает устойчивость микроскопа. К штативу прикреплен предметный столик, по форме он круглый (в старых системах микроскопов встречается четырехугольный). На его поверхности для фиксации предметных стекол расположены клеммы. По сторонам предметного столика находятся винты, при помощи которых он перемещается в двух взаимно перпендикулярных направлениях.

С основанием микроскопа соединен дугообразный тубусодержатель. Впереди него расположено револьверное устройство, состоящее из двух пластин. Нижняя пластина вращается и имеет гнезда для ввинчивания объективов, верхняя – закреплена неподвижно. Тубус может быть наклонный и прямой, в верхнюю часть которого вставляется окуляр. Передвижение тубусодержателя и смонтированных на нем систем осуществляется при помощи винтов. Для грубой наводки служит макрометрический винт, для более точной – микрометрический, полный оборот которого опускает или поднимает тубусодержатель на 0,1 мм. На барабане микрометрического винта нанесено 50 делений, каждое из которых соответствует перемещению системы на два микрометра. Микрометрический винт быстрее других частей поддается ломке, поэтому обращение с ним должно быть осторожным, не рекомендуется вращать его до предела.

Оптическая часть включает объективы, окуляры и осветительный аппарат.

Объективы – самая важная и наиболее ценная часть микроскопа. Они представляют собой систему линз, заключенных в металлическую оправу, количество которых доходит до десяти. Передняя (фронтальная) линза – самая маленькая, она производит основное увеличение. Чем больше кривизна этой линзы, тем больше увеличение. Остальные линзы (коррекционные) исправляют недостатки оптического изображения. Объективы делят на ахроматы и апохроматы. Ахроматы имеют дефект – хроматическую аберрацию (происходит разложение света на составные части спектра). Они просты по устройству и дешевы, поэтому нашли большее распространение. Апохроматы лишены этого недостатка. Они состоят из большого числа линз, изготовленных из стекла разного химического состава.

Все объективы по способу употребления делят на сухие и иммерсионные (маслянопогружные). В сухих объективах между фронтальной линзой и рассматриваемым препаратом которых находится воздух. В иммерсионных же объективах пространство между фронтальной линзой и препаратом заполнено маслом: кедровым, касторовым, гвоздичным и др.

Стекло, из которого изготовлен препарат, стекло объективов и масло (кедровое) имеют почти одинаковый показатель преломления света (1,52 и 1,515). Лучи, проходя из одной стороны в другую, почти не преломляются, рассеиваются, происходит частичное искажение рассматриваемых предметов. Но так как сухие системы дают сравнительно небольшое увеличение, то сильных искажений рассматриваемых предметов не происходит.

Для иммерсионных объективов характерно короткое фокусное расстояние и большое увеличение. Поэтому расстояние между фронтальной линзой и рассматриваемым объектом невелико, что требует аккуратного обращения при пользовании этой системой во избежание повреждения линзы и препарата. Сухие системы объективов имеют следующие обозначения: x8, x40, иммерсионные – x90.

Окуляры – вставлены в верхнюю часть тубуса. Состоят они из двух плосковыпуклых линз, обращенных своими выпуклыми сторонами к объективу, и заключены в металлическую оправу. Между линзами имеется постоянная диафрагма. Линза, обращенная к глазу, называется глазной, к объективу – собирательной. Короткие окуляры дают более сильное увеличение, длинные – слабое. Окуляры, в зависимости от увеличения, обозначаются: x7, x10, x15, x20. Общее увеличение микроскопа равно показанию увеличения объектива, умноженному на показание увеличения окуляра.

Осветительный аппарат находится под предметным стеклом и представлен: конденсором Аббе, диафрагмой и зеркалом. Конденсор Аббе состоит из системы линз, заключенных в металлическую оправу и предназначенных для собирания лучей света, идущих от зеркала. Ирисовая диафрагма находится под конденсором и служит для регулирования освещения препарата путем сужения или расширения ее при помощи рычага. Окрашенные препараты, которые частично задерживают свет, рассматривают при открытой диафрагме. Неокрашенные препараты (висячую или придавленную капли) рассматривают с полуоткрытой диафрагмой, в слабом пучке света. В таком поле зрения увеличивается контрастность неокрашенных форм микробов, что облегчает их нахождение. Зеркало имеет плоскую и вогнутую поверхность и служит для отражения световых лучей. Плоским зеркалом пользуются при хорошем естественном освещении и при микрофотосъемках, вогнутым - при искусственном и слабом естественном освещении.

Микроскоп МБИ-1 имеет два тубуса: наклонный и вертикальный. Наклонный тубус позволяет рассматривать предметы без наклона предметного столика. Макро- и микрометрический винты расположены в нижней части штатива при их вращении руки лежат на столе, и длительная работа не вызывает усталости. При вращении макрометрического винта одновременно справа на себя, а слева от себя тубус передвигается свободно, при вращении наоборот – движение тубуса затруднено, что особенно важно при микрофотосъемках. Бинокулярные микроскопы МБИ-2 и МБИ-3 дают два наклонных тубуса, что дает возможность рассматривать препарат обоими глазами одновременно.

Работа с иммерсионной системой. Вначале под малым увеличением микроскопа (объектив x8) наводят свет и определяют на препарате участок микроскопирования. Затем на выбранное место наносят каплю кедрового масла и осторожно (под контролем глаза сбоку) погружают в нее фронтальную линзу иммерсионного объектива (x90).

Иммерсионные объективы имеют короткое фокусное расстояние (до 1,3 мм), поэтому наводить на резкость следует путем поднимания объектива, а не опускания, так как при небольшом рабочем расстоянии можно раздавить препарат или повредить фронтальную линзу. После грубой наводки, которую проводят с помощью макрометрического винта, руки переводят на микрометрический винт и осуществляют более точную наводку на резкость. По окончании работы поднимают тубус, убирают препарат, а с фронтальной линзы снимают масло фланелевой тряпочкой. Оставлять надолго (часы) систему в масле не рекомендуется. Если масло засохло, нужно ваткой, слегка смоченной чистым бензином или ксилолом, увлажнить поверхность линзы и тотчас же протереть сухой тряпочкой. Следует помнить, что эфир, спирт и особенно ксилол способны растворять вещество, которым склеены линзы объектива. Тубус нельзя оставлять без окуляра, иначе в него может попасть пыль, которая оседает на линзы объектива и загрязняет их. По окончании работы микроскоп тщательно вытирают чистой салфеткой (тряпочкой) и ставят в футляр или под стеклянный (плексигласовый) колпак.