Лабораторная работа № 5. ПИТАТЕЛЬНЫЕ CPEДЫ.

Питательной средой называют среды, содержащие различные соединения,

которые применяются для размножения микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях. В 1930 году их было чуть менее двух тысяч, но число компонентов, относительно невелико, а их композиции создаются на определенных общих принципах. Питательная среда должна: содержать все необходимые для роста питательные вещества в легко усвояемой форме; иметь оптимальную влажность, вязкость, рН, быть изотоничной, сбалансированной с высокой буферной емкостью и, по возможности, прозрачной.

Для роста автотрофных бактерий необходимы: вода, двуокись углерода и соответствующйе неорганические соли.

Гетеротрофные бактерии используют органические соединения: 1) как источник энергии; при этом органическое вещество расщепляется с высвобождением энергии и образованием конечных продуктов СО₂, органических кислот и др; 2) как субстрат, для синтеза клеточных компонентов в реакциях, требующих затрат энергии. Так, E.coli способна рости на простой среде, содержащей глюкозу и неорганические соли. Молочнокислые бактерии растут на сложных средах, содержащих органические соединения (витамины, аминокислоты и др.), которые клетки не могут синтезировать самостоятельно. Такие соединения называются факторами роста. Организмы, которые нуждаются в их добавлении к ростовой среде, называются ауксотрофными по соответствующим соединениям. Организмы, способные к росту на простых средах, содержащих источник углерода и энергии, и набор основных биогенных элементов называются прототрофными. В природе встречаются бактерии, которые способны размножаться в местах с низким пищевым потоком углерода - до 0,1' мг/л в день они называются олиготрофными, а бактерии способные к росту на богатых пищевых субстратах - копиотрофные. Выбор питательной среды зависит от целей эксперимента.

Классификация питательных сред:

1. По составу:

- натуральные - среды, которые состоят из продуктов расти~льного или животного

,

происхождения, имеющих неопределенный химический состав н-р, смесь продуктов

распада белков (казеина, мышц млеко питающих), образующихся при их гидролизе. Для приготовления полных гидролизатов используют кислотный (HСl) гидролиз белков. Действие ферментов трипсина, панкреатина, папаина, приводит к частичному гидролизу белков, в результате образуются пептоны. Как правило, на пептонных питательных средах микроорганизмы растут лучше, чем на средах, из полных гидролизатов или смесей аминокислот. Вероятно, при ферментативном гидролизе, сохраняются факторы роста; многие микроорганизмы лучше размножаются на средах, содержащих небольшие пептиды, потому что их они могут усваивать непосредственно, а отсутствующие аминокислоты - нет. В составе такой среды ферментативный гидролизат белка обеспечивает потребность в азоте, н-р, аминокислоты; углеводы (глюкоза) - источник углерода и энергии, соли - неорганических ионов, а дрожжевой экстракт - витаминов. К питательным средам неопределенног6 состава относят среды, полученные на основе растительного сырья: картофельный и томатный агар, отвары злаков, дрожжей, пивное сусло, настои сена, соломы и др. Основное назначение таких питательных сред ­выделение, культивирование, получение биомассы и поддержание культур микроорганизмов.

- полусинтетические среды относят к средам неопределенного состава, в них вносят известные необходимые соединения и добавляют небольшое количестве природного продукта (дрожжевого или кукурузного экстракта) для обеспечения неизвестных потребностей роста. Их используют при промышленном культивировании биологических объектов для получения продуктов метаболизма.

- синтетические - это среды определенного состава, представленные чистыми химическими соединениями, в точно указанных концентрациях и соотношениях отдельных элементов. Обязательными компонентами являются: неорганические соединения (соли) и углерод- и азотсодержащие веществ н-р, глюкоза и (NН₄)₂S0₄ Часто к таким средам добавляют буферные растворы и халатирующие соединения. Ауксотрофные организмы растут на таких, средах только при добавлении соответствующих факторов роста. Основное значение этих питательных сред - изучение особенностей физиологии и метаболизма микроорганизмов, выделение генетических рекомбинатов и т. д.

2. По назначению:

- элективные среды обеспечивают преимущественное развитие одного или целой физиологической группы микроорганизмов] Н-р, для выделения грамотрицательных бактерий в питательную среду д9бавляют трифенилметановые красителей (кристаллический фиолетовый, малахитовый зеленый и т. д.); стафилоккоков ­хлористый натрий в концентрации 7,5% (при этой концентрации рост других бактерий подавляется); уксуснокислых бактерий - пиво с добавлением 2-4% этилового спирта ;Элективные среды применяются на первом этапе выделения чистой культуры бактерий т.е. при получении накопительной культуры.

- дифференциально-дuагностические среды применяются для быстрой идентификации близкородственных видов микроорганизмов, для определения видовой принадлежности в клинической бактериологии и. др. Принцип построения дифференциально-диагностических сред основан на том, что разные. виды бактерий различаются между собой по биохимической активности и имеют неодинаковый набор ферментов расщепляющих субстраты, входящие в состав питательной среды. В состав дифференциально-диагностической среды входят: а) основная питательная среда обеспечивающая размножение бактерий; б) определенный химический субстрат отношение к которому является диагностическим признаком для данного микроорганизма; в) цветной индикатор, изменение. окраски которого свидетельствует ( биохимической реакции _ и наличии данной ферментной системы у исследуемого микроорганизма. Н-р, среда Эндо позволяет отличить клоны, сбраживающие лактозу отклонов, не обладающих этим свойством. Исходная питательная среда окрашена в розовый цвет и основными компонентами ее являются пептонный агар, углевод в основной фуксин, обесцвеченный сульфитом (реактив Шиффа). Микроорганизмы, не сбраживающие лактозу, образуют бесцветные колонии. При сбраживании лактозы до ацетальдегида, он реагирует с сульфитом и развивается красная окраска колоний. Среда Левина в качестве индикаторов содержит эозин и метиленовый синий и исходно окрашена в чёрно-синий цвет. Клетки, осуществляющие брожение, образуют колонии окрашенные в чёрный с металлическим блеском цвет, а колонии, не обладающие этим свойством, бесцветны. Данная среда позволяет дифференцировать бактерии рода Escherichia от бактерий рода Proteus.